乳源生物活性肽研究进展

赵烜影，刘振民，雍靖怡，王国骄，李 楠

（乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436）

牛乳行业是全球最多样化和发展最密集的乳制品行业，导致针对不同年龄人群的目标乳制品配方多样化，以满足特定的营养需求[1]。根据联合国粮农组织的数据，2020年全球乳产量达到8.6 亿t，其中牛乳占总产量的85.37%，其次是水牛乳（11.06%）、山羊乳（2.07%）、绵羊乳（1.36%）和骆驼乳（0.20%）[2]。牛乳被认为是重要的能量来源，并且含有必需的营养素，是蛋白质、碳水化合物（乳糖）、脂质、矿物质、维生素、低聚糖、内在免疫因子、免疫球蛋白、激素、酶和转化生长因子β等的来源[1,3]。作为人类饮食中重要的蛋白质来源，牛乳提供约32 g/L的蛋白质[4]，在人体内不同的功能机制中发挥着重要作用，如调节心血管疾病、免疫调节、代谢和神经元生长以及肠道微生物组的建立和稳定[5-7]。 由于蛋白质含量高，牛乳被视为潜在生物活性肽的良好来源[3]。目前已知的乳源生物活性肽是由牛乳中的2 种主要蛋白质酪蛋白（主要包括α-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白）和乳清蛋白（主要包括α-乳白蛋白和β-乳球蛋白）分解而来[8]。尽管其他动物蛋白和植物蛋白都含有潜在的生物活性序列，但乳蛋白仍是目前一系列生物活性肽的主要来源[9]。在过去的70 年里，已经对乳蛋白氨基酸序列中存在的生物活性肽进行了许多研究[10]。早在1950年，Mellander[11]发现来源于酪蛋白的磷酸化肽的摄入可改善儿童的VD非依赖性钙化。

生物活性肽被定义为对身体功能或状况有积极影响并最终影响健康的特定蛋白质片段[12]，最初它们在体内保持无活性乳蛋白的结构，可通过蛋白水解释放[13]，释放的生物活性肽通常很小，包含2～50 个氨基酸残基[14]。食物来源的生物活性肽具有有益健康的成分，除了正常的基本营养作用外，还可以在人体中发挥调节功能[15]。生物活性肽被认为是药物的更好替代品，它们主要来源于天然食品并且没有严重的副作用，因此成为治疗长期慢性疾病的最佳方法之一[16]。乳蛋白衍生的生物活性肽的产生和性质已在许多文章中进行了综述，许多在牛乳中发现的肽已被证明会影响心血管、神经、消化、内分泌和免疫系统[3,16]，同时显示出抗微生物、抗血栓形成、抗高血压、抗动脉粥样硬化、抗氧化等功能特性和免疫调节活性[17-19]。

目前国际市场上已经出现了含有乳源生物活性肽的产品。本文综述近年来乳源生物活性肽的来源、生产方式及生物活性的相关研究进展，概述乳源生物活性肽的应用潜力。

1 乳源生物活性肽来源

乳源生物活性肽衍生自乳蛋白。在牛乳、绵羊乳、山羊乳和水牛乳中约80%的乳蛋白是酪蛋白。酪蛋白作为一种磷酸化蛋白质，以蛋白质和矿物质磷酸钙的复杂胶束形式存在于乳中，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白是主要的酪蛋白组分[20]。β-酪蛋白经纤溶酶酶解产生的γ-酪蛋白也可以形成生物活性肽[21]。在乳中，乳清蛋白含量约占20%，由β-乳球蛋白（50%）、α-乳白蛋白（20%）、血清白蛋白（10%）及乳铁蛋白4 种主要蛋白质和其他蛋白质（免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）， 10%，主要为IgG1，IgG2、IgA和IgM含量较少）组成[22]。 乳中常见的多肽如表1所示。

表1 常见乳源生物活性肽[10]Table 1 Common milk-derived bioactive peptides[10]

2 乳源生物活性肽产生方式

乳中的生物活性肽可通过酶促水解或发酵过程获 得[23-26]。除了通过常规蛋白酶酶解从天然蛋白来源生产生物活性肽以外，重组DNA技术已成功用于大肠杆菌中生产特定的肽或其前体[19,27-28]。

2.1 酶解

产生生物活性肽的最常见方式是通过酶水解蛋白质。大量研究表明，消化酶水解乳蛋白可以产生具有生物活性的肽[29]。乳蛋白在体内胃肠消化过程中通过消化酶可以分解出一系列生物活性肽，如乳清蛋白经肠道内的胰蛋白酶消化可产生具有ACE抑制活性的乳激肽Ala-Leu-Pro-Met-His-Ile-Arg（ALPMHIR）[29]。ACE抑制肽是现阶段关注度较高的生物活性肽，一些研究发现，酪蛋白酶解产物比乳清蛋白酶解产物具有更高的ACE抑制活性[19]。体外消化通常使用不同pH值的缓冲液，以获得最佳的水解酶活性[30]。目前最常用到的蛋白酶有胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶，通过单独或组合使用水解酪蛋白或乳清蛋白等乳蛋白，从而产生生物活性肽[31-33]。有时为了模拟胃肠道消化，还会采用碱性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等蛋白酶与胃蛋白酶和胰蛋白酶一起进行连续处理来释放各种生物活性肽，包括环瓜氨酸肽、ACE抑制肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫调节肽和阿片样物质[19]。Mizuno等[34]测定用9 种不同的市售蛋白酶处理酪蛋白后水解物的ACE抑制活性，发现经源自米曲霉的蛋白酶处理后酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高。

2.2 发酵

除了酶解消化外，另一种生产生物活性肽的方式是利用微生物的蛋白水解系统进行发酵[35]。部分微生物可以将乳蛋白水解成肽和氨基酸，作为其生长所需的氮源，水解释放的肽可以通过超滤或分子筛分离纯化，生物活性肽的氨基酸序列可以通过色谱方法鉴定[27,36-37]。许多乳制品发酵剂都可以高度水解乳蛋白，因此在发酵乳制品的生产过程中可以预期形成生物活性肽[27]。通过微生物水解牛乳蛋白，释放出不同的生物活性肽，已有许多文献报道[38]。瑞士乳杆菌菌株能够释放抗高血压肽，其中最著名的是ACE抑制性三肽Leu-Pro-Pro（LPP）、Val-Pro-Pro（VPP）和Ile-Pro-Pro（IPP），这些肽的抗高血压能力已在一些大鼠模型和人体研究中得到证实[19,39]。用粪肠球菌发酵牛乳可产生抗高血压的酪蛋白衍生肽LHLPLP和HLPLP[40]。酸乳中的细菌、干酪发酵剂和市售益生菌也被证明在发酵过程中会在牛乳中产生不同的生物活性肽[19,39]。

2.3 重组DNA技术

目前采用重组DNA大规模生产生物活性肽的技术还处在探索阶段，研究重点在于长链肽的合成[41-42]。DNA重组技术在制备长链肽方面具有高产的优势，抑制对宿主有害产物的表达是该技术目前最大的挑战[43-44]。此外，抗菌肽对表达载体具有很强的抗菌活性，并且对蛋白酶的活性比较敏感[45]。通过融合蛋白或串联基因的形式表达这些生物活性肽可能会克服部分限制，这可能抵消其固有的毒性并提高其表达水平[27]。

3 乳源生物活性肽的生物活性

3.1 对消化系统的影响

牛乳在体内胃肠道消化过程中会产生酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPP）[46]。Meisel等[47]在回肠造口术废液中发现了CPP，证明这些肽产生于胃肠道消化过程，且能够到达回肠远端。CPP因能够促进人体对钙、铁、锌等矿物营养素的吸收和利用而受到学者们的关注[46]。 现阶段对于CPP的研究主要集中在早期龋齿预防[48]， 研究发现，CPP有助于牙釉质龋损体的再矿化作用[49]。此外，有学者发现CPP可以增加大鼠骨密度，促进神经肽Y的表达，利于大鼠骨骼的发育[50]。

酪蛋白巨肽（caseinmacropeptide，CMP）是κ-酪蛋白经凝乳酶降解产生的一类多肽，具有生物活性功能和独特的营养特性[51]。CMP化学结构中磷酸基团的 不同修饰作用产生的不同序列片段可支持不同的生物学功能[52]。CMP已被证明可以直接作为神经递质，或刺激相关激素的释放，调节胃肠道分泌，它可以抑制胃酸的分泌，通过释放胆囊收缩素刺激胰腺分泌[53]。CMP还能通过刺激产生短期食欲的胃肠激素（如胆囊收缩素、胰高血糖素样肽-1、肽YY）及长期作用的激素（如瘦素和胰岛素）两类外周食欲调控信号的释放，进而发挥对机体食欲的调节作用[52]。

糖巨肽（glycomacropeptide，GMP）是一种含有唾液酸的活性糖基磷酸肽，由κ-酪蛋白被凝乳酶特异性水解其中的苯丙氨酸-蛋氨酸间的酰胺键得到，GMP肽链上糖基和磷酸基团的不同造就了其多样化的生物功能活性[51]。GMP可以通过下调脂多糖诱导的Toll样受体4炎症途径以及阻止肿瘤坏死因子-α诱导的共培养单层渗透性增强肠道的抗炎和屏障功能[54]。酪蛋白GMP中支链氨基酸含量较高，且几乎不含苯丙氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，被视为苯丙酮酸尿症患者的理想膳食[55]。此外，GMP被证明可以促进乳酸杆菌和双歧杆菌的生长，并增强肠道内微生物多样性，GMP的肽骨架对益生元活性也至关重要[56-57]。

3.2 对免疫系统的影响

3.2.1 抗菌作用

抗菌肽又称宿主防御肽，是生物界中广泛存在的一类生物活性肽，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分，一般由20～60 个氨基酸残基组成，结构多样，具有抗细菌、真菌、病毒等多种生物学功能[46]。乳源生物活性抗菌肽因具有识别受感染的靶细胞、广谱杀菌及天然安全性等优势受到关注，这些活性肽能够破坏细菌的膜通透性[58]，抑制许多革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体，如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌和葡萄球菌[59]。从乳铁蛋白中分离出的乳铁素可以抑制葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌[60]。

3.2.2 抗氧化作用

乳蛋白经消化后可以产生具有抗氧化活性的多肽，这些肽由5～11 个氨基酸组成，包含疏水性氨基酸、脯氨酸、组氨酸、酪氨酸或色氨酸[61]。乳源抗氧化肽能通过多种途径抑制脂质氧化，包括使活性氧失活、清除自由基、螯合金属离子、减少氢过氧化物和改变食品体系的物理性质等，调整及改善机体生理功能，从而促进人体健康[62]。Suetsuna等[63]发现，酪蛋白水解得到的Tyr-Phe-Tyr-Pro-Glu-Leu（YFYPEL）乳源活性肽对超氧阴离子、羟自由基和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基具有清除活性，这表明酪蛋白衍生的Glu-Leu序列对于上述自由基清除很重要。乳清蛋白的水解产物已被证明具有抗氧化活性，用碱性蛋白酶消化5 h能够产生具有强还原能力的水解产物[64]。Barac等[65]发现，干酪成熟过程中会产生具有抗氧化作用的α-酪蛋白衍生肽和β-酪蛋白衍生肽。

3.2.3 免疫调节作用

免疫系统在保护个体免受细菌、病毒、寄生虫或真菌感染和癌症的侵害中起着核心作用[46]。生物活性肽对个体的免疫系统也具有积极的刺激作用[66]。酪蛋白产生的细胞调节肽可通过刺激负责免疫系统的细胞抑制喉癌细胞的生长，可用于肺癌的治疗[67-69]。免疫调节肽PGPIPN是源于牛乳β-酪蛋白63～68位氨基酸残基的六肽，通过泛素-蛋白酶体途径降低卵巢癌细胞对抗癌药顺铂的耐药性[70]。由乳清水解得到的免疫调节肽HWP可显著降低肝移植后菌血症的发病率[71]。

3.3 对心血管系统的影响

3.3.1 抗血栓作用

具有抗血栓形成功能的生物活性肽具有减少或预防血凝块形成的能力。纤维蛋白原在血液凝结中起重要作用，CMP可以抑制纤维蛋白原与血小板表面的糖蛋白受体结合，进而防止血小板聚集[72]。Tu Maolin等[73]通过胰蛋白酶水解酪蛋白得到对凝血酶抑制率为76.25%的多肽，其中序列为HQGLPQEVLNENENLLR、FFVAPFPEVFGK、DEVPSER、YLGYLEQLLR的4 种肽来自于αs1-酪蛋白，序列为NMAINPSK、NAVPITPTLIVR、FALPQYLY的3 种肽来自于αs2-酪蛋白，序列为VLPVPQK、AVPYPQR、GPFPIIV的3 种肽来自于β-酪蛋白。

3.3.2 降压作用

高血压可引起中风、心力衰竭、缺血性心脏病和肾脏疾病，肾素血管紧张素被认为是重要的血压调节剂，因此抑制肾素作用于血管紧张素原的ACE被广泛用于治疗高血压[8]。目前已从牛乳、羊乳、骆驼乳和马乳中鉴定出多种ACE抑制肽[26,74]。缓激肽分解后产物会与血管紧张素II产生协同作用，ACE抑制肽还可以防止缓激肽的分解，从而通过增加动脉血管舒张作用来降低血压[75]。当用瑞士乳杆菌或酿酒酵母发酵牛乳时，β-酪蛋白会释放出IPP、VPP和LPP 3 种三肽[39]。在临床实验中，急性摄入高剂量的三肽后，血压正常志愿者的血浆缓激肽浓度增加，并且含三肽的乳制品可以降低轻度高血压人群的血压[39,76]。

3.4 对神经系统的影响

参与活跃神经系统、具有阿片样活性的肽被称为阿片肽，阿片肽同鸦片（吗啡）有相似的药理[77]。阿片肽是具有激动剂活性和拮抗活性的阿片样物质受体配体，牛乳中的阿片肽属于外源性阿片肽[78]。α-酪蛋白和β-酪蛋白被认为是外源性阿片肽的良好来源，来源于β-酪蛋白的β-酪啡肽7是第1个被鉴定出的阿片肽（Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile）[79]。来源于β-酪蛋白的β-酪啡肽对大脑功能、镇静和婴儿睡眠以及焦虑等行为的调节存在潜在影响[80]。还有研究显示，β-乳球蛋白、免疫球蛋白、α-乳白蛋白、乳过氧化物酶、乳铁蛋白等组成的乳清蛋白具有阿片样活性[81]。

3.5 对骨骼健康的影响

乳源生物活性肽可以在体外诱导成骨细胞分化、成熟和基质矿化，因此可能对绝经后骨质疏松症具有有益作用[82]。用三肽IPP长期治疗可提高人类前成骨细胞存活率，进而改善基质矿化[83]。此外，水牛乳酪蛋白经胃蛋白酶-胰蛋白酶水解可获得具有抗氧化和成骨细胞增殖活性的生物活性肽，其中NAVPITPTL通过激活磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶信号通路显著增加成骨细胞分化，VLPVPQK通过抑制去卵巢大鼠的氧化损伤和骨吸收细胞因子的产生，从而表现出抗骨质疏松作用[84-85]。

4 结 语

生物活性肽作为促进健康的功能性食品受到研究人员的关注，但是该领域的发展受到缺乏创新技术、分离纯化和临床研究的限制。在后续的发展过程中应该以蛋白质组学、重组DNA技术及微生物发酵等新技术为依据，将各种生物活性肽表现出的促健康作用标准化。并且要鼓励研究机构加大对临床实验的投入，以测试其对人体的有效性。

乳源生物活性肽因其潜在的健康益处而成为商业功能性食品的热点。迄今为止，对食源性生物活性肽降压、矿物质结合、抗龋肽的生理作用进行了较为深入的研究，但食源性生物活性肽在预防和治疗慢性疾病中的作用尚缺乏深入研究。肥胖症及相关慢性疾病的治疗应关注对天然生物活性肽的研究，预计会有更多基于乳源生物活性肽的产品被用于干预各种代谢综合征，例如影响高血压、血脂水平、葡萄糖平衡和体重指数。乳源生物活性肽的新研究领域是与记忆有关的疾病和情绪控制，在这种趋势下许多具有抗氧化和阿片样物质性质的乳源生物活性肽值得进一步研究。