枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物对鲤鱼生长性能、血清生化指标、免疫指标及抗氧化功能的影响

王红涛，冯 颖，明美玉，陈之恒，宋婧婧，孙 莹，肖 智

（通化师范学院生命科学学院，吉林通化 134002）

近年来，水产养殖环境日益恶化，导致养殖动物的病害甚至重大疾病频发。由于传统抗菌药物具有在动物体内残留、引起病原菌的耐药性等缺点，而水生食品的安全问题也备受关注。现如今，中草药和益生菌作为两大类新型饲料添加剂，均具有无毒害、无药残、功能全面等优点[1-2]，已得到广泛关注并成为研究热点。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是水产养殖中常用的优势益生菌之一，不仅可以促进机体对营养物质的吸收，促进机体产生各种消化酶，提高饲料利用率，促进动物生长发育，提高免疫功能，还具有抑制致病菌群的生长繁殖、维持肠道微生态平衡等多种功能[3-4]；蒲公英属菊科多年生草本植物，为药食同源药材[5]，其提取物中含有蒲公英醇、多糖类、有机酸、生物碱及皂苷等多种活性成分，具有调节机体免疫、保护肝脏、降血糖、抗氧化等生物功能[6]。近年来，已有研究表明，蒲公英及其提取物作为饲料添加剂，广泛应用于鱼[7]、鸡[8]及猪[9]等动物中，可直接补充物质能量，促进动物食欲、增强机体抵抗力，还可通过预防疾病来确保动物健康生长[7]。

饲料中添加中草药和益生菌可使两者发挥协同作用优势。然而，目前关于将枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物复配应用到鱼类饲料中的研究鲜有报道。因此，本试验旨在探讨日粮中添加枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物对鲤鱼生长性能、血清生化指标、免疫指标及抗氧化功能的影响，为枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物二者复合在鱼类生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 枯草芽孢杆菌由山东宝来利来生物工程股份有限公司菌种保藏中心提供。在使用之前，采用振荡器在30℃有氧条件（150 r/min）LB 培养基中培养18 h，备用，其中枯草芽孢杆菌活菌数为2×107CFU/g。

全株蒲公英样品购买于西安圣青生物科技有限公司，参考吴晓丽等[10]方法制备蒲公英提取物，提取物主要组成为总黄酮和多糖，其含量分别为5.51% 和14.91%。

1.2 试验设计 选取720 条健康无病、初始体重（31.56±2.31）g 和体长（16.78±0.96）cm 的鲤鱼（吉林省通化市某水产养殖厂），预试验为14 d，正式试验周期为56 d。饲养于室内玻璃水族箱（1 m×0.5 m×0.5 m）中，每个鱼池中放养30 条，随机分为4 组，每组6 个重复。对照组饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加2×107CFU/g、100 mg/kg 蒲公英提取物、2×107CFU/g枯草芽孢杆菌+100 mg/kg 蒲公英提取物，添加量参照前人研究结果[11-12]饲喂，各组间饲养管理无差异，基础日粮组成及营养成分见表1。试验原料经粉碎过120 mm 目筛。在冷却条件下，将枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物复配与基础日粮分混合，制成直径为2.0 mm 的颗粒，存放在4℃冰箱中备用。预试期为14 d，正试期为56 d。

表1 基础日粮组成及营养成分

1.3 饲养管理 各组饲养管理一致。试验期间，水温控制在（22.5±2.0）℃，溶解氧为（6.05±0.14）mg/L，pH 为（7.53±0.02），亚硝酸盐＜0.05 mg/L，每天换去水族箱内1/3 水并换洗滤布。日投喂量为每组鱼总重的2%，每天2 次（09:00，16:00）向鱼提供饲料。自然光周期（约13 h 光照:11 h 黑暗）。

1.4 样品采集 试验结束时，将鱼禁食24 h，然后再收集样品，从每组中随机取12 条鱼，用注射器尾静脉采血，4℃静置2 h，待血液凝固析出血清后，用冷冻离心机4℃、8 000 r/min 离心20 min，分离出血清，用于测定血清生化指标。将鱼采血后立即剖开腹部，剥离出肝脏并称重，用生理盐水冲洗干净并用滤纸吸干后称重，肝脏和生理盐水按1:9（m/V）的比例冰浴匀浆，用冷冻离心机4℃、8 000 r/min 离心20 min，取上清液测定抗氧化指标。试验鱼用300 mg/L 的甲烷磺酸盐222（MS-222）安乐死，将所有样品冷冻在液氮中，并在-80℃下保存直至试验测定。

1.5 指标测定及方法

1.5.1 生产性能 试验初始和试验结束时，将试验鱼禁食24 h，统计每组存活条数，测量每组标记鱼的体重和体长，记录投料量和采食量，生长性能指标计算公式：

增重率（WGR）=（最终均重－初始均重）/初始均重×100%

特定生长率（SGR）=100%×（ln 最终长度－ ln初始长度）/天数

肥满度（CF）=最终重量/最终体长 ×100%

存活率（SR）=最终条数/初始条数×100%

饲料系数（FCR）=饲料摄入量/（最终总重量－初始总重量）

1.5.2 血清生化指标、免疫指标 总蛋白（TP）采用双缩脲法，白蛋白（ALB）采用溴甲酚绿法，球蛋白（GLB）采用酶联免疫法，甘油三酯（TG）、胆固醇（CHO）采用酶终点比色法，血糖（GLU）采用己糖激酶法，肌酐（Cr）采用碱性苦味酸法，碱性磷酸酶（ALP）活性采用AMP 缓冲液法，谷丙转氨酶（ALT ）、谷草转氨酶（AST）采用酶连续测定法，均使用全自动生化分析仪进行检测。

免疫球蛋白IgM 采用酶联免疫吸附法（ELISA），补体3（C3）和补体4（C4）采用免疫透射比浊法，血清溶菌酶（LSZ）含量采用比浊法，均使用全自动生化分析仪进行检测。

1.5.3 肝脏抗氧化指标 谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定，并严格按照试剂盒的操作说明进行。

1.6 统计分析 试验数据采用Excel 2007 处理及SPSS 20.0 统计软件进行方差分析，用Duncan's 法进行多重比较，试验结果采用平均值± 标准差表示。当P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼生长性能的影响 由表2 可知，枯草芽孢杆菌组+蒲公英提取物组WGR 高于其他各组（P＜0.05）；此外，枯草芽孢杆菌组与蒲公英提取物组WGR 之间差异不显著。枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组FCR 分别比对照组、枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组降低39.63%、21.23%、10.35%（P＜0.05）。各组SGR、CF 和SR 之间无显著差异，但枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组鱼的FBW 高于其他各组（P＜0.05）。

表2 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼生长性能的影响

2.2 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼血清生化、免疫指标的影响 由表3 可知，枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组及两者复合组的TP、GLB 和TG 含量与对照组均无显著差异，各试验组ALB 含量均高于对照组（P＜0.05），枯草芽孢杆菌组、枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组GLU 含量低于对照组（P＜0.05），而枯草芽孢杆菌组GLU 含量略低于基础日粮组（P＞0.05），枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组、枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组血清中CHO 浓度较对照组分别降低25.98%、31.52%、38.25%（P＜0.05），蒲公英提取物组、枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物组Cr 含量较对照组均降低（P＜0.05），各组间鲤鱼ALP 活性均无显著性差异，3 个试验组与对照组相比，血清ALT、AST 含量均降低（P＜0.05），枯草芽孢杆菌组与蒲公英提取物组差异不显著，且枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组鱼的血清ALT 含量最低。

表3 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼血清生化指标的影响

由表4 可知，与对照组相比，3 个试验组鱼的免疫球蛋白IgM 含量、血清LZM 均提高（P＜0.05），C3、C4 活性均增加（P＜0.05），其中枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组各指标含量最高。

表4 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼免疫指标的影响

2.3 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼肝脏抗氧化功能的影响 由表5 可知，枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组及两者复合组鱼肝脏MDA 含量均较对照组降低（P＜0.05），且GSH-Px、GST、CAT 活性高于对照组；枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组的T-AOC、SOD 活性高于其他组（P＜0.05），枯草芽孢杆菌组与蒲公英提取物组间无显著性差异。

表5 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼肝脏抗氧化功能的影响

3 讨 论

3.1 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼生长性能的影响 本试验结果表明，鲤鱼饲料中添加枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物及两者复合物 均可提高鲤鱼的WGR，使其FCR 降低，从而提高了饲料转化率，而两者复合使用效果更显著，说明饲料中添加枯草芽孢杆菌+蒲公英对鲤鱼的生长具有促进作用。赵倩等[13]研究也表明，在鲤鱼日粮中添加2%、3% 枯草芽孢杆菌发酵中药制剂可显著提高鲤鱼的生长性能。枯草芽孢杆菌也是鲤鱼肠道内重要的益生菌。在鲤鱼日粮中添加枯草芽孢杆菌提高了鲤鱼肠道菌群丰度，并降低有害菌数量，从而改善鲤鱼肠道健康，提高了肠道的营养利用率，进而提高了鲤鱼的生长性能[14]。何伟聪等[15]研究也表明，投喂枯草芽孢杆菌与嗜酸乳杆菌混合物为2×107CFU/g 时，军曹鱼幼鱼增重率明显提高，饲料系数显著低于对照组。研究发现，蒲公英提取物能够促进鲫鱼生长，提高鲫鱼消化道内胃蛋白酶和淀粉酶活性[12]。此外，本研究结果还表明，枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物对鲤鱼饲料转化率的提高优于单独添加。

3.2 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼血清生化、免疫指标的影响 血清生化指标常用来评价鱼体健康和营养状况等，血清TP、ALB、GLB、TG、GLU、CHO含量可以反映机体蛋白质、脂类吸收与代谢状况[16]。血清TP 包括ALB 和GLB，血清ALB 维持血浆胶体渗透压，GLB 参与机体特异性免疫，在机体中具有重要的生理功能[17]。不同浓度的枯草芽孢杆菌发酵中药制剂可以提高鲤鱼TP 含量[13]。本试验发现，枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组及两者复配组TP 含量与与对照组无显著差异，这一结论与前人研究结果不同，这可能是本研究所使用的为枯草芽孢杆菌，而其他研究所使用的为枯草芽孢杆菌中药制剂，其中含有一些特殊成分，而导致鲤鱼血清中TP 含量升高。彭小玉等[12]研究表明，日粮中添加蒲公英提取物可显著改善鲫鱼生长性能，但对鲫鱼血清TP、TG 含量均无显著影响，此研究结果与本试验结论相似。本试验结果发现，单独添加枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物、两者复合物均使GLU 浓度降低，而蒲公英提取物组和两者复合组GLU 浓度下降更显著，这与蒲公英提取物具有降血糖作用[18]基本一致，推测蒲公英提取物具有降血糖作用，可能是由于减少了肠道吸收GLU 入血，且枯草芽孢杆菌对机体糖类代谢有调节作用。本试验结果显示，枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组、枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物组鲤鱼血清中CHO 浓度均显著降低，可能是由于蒲公英提取物中含有低聚糖。有研究发现低聚糖能有效降低CHO 含量[19]。李美菊[7]研究发现，蒲公英提取物能使CHO 浓度降低，改善罗非鱼血液生化指标，与本研究结果基本一致。Cr为肌酸的代谢产物，主要由肾小球滤过后排出体外，当肾功能发生明显障碍时，肌酐含量上升[20]，本研究结果表，试验组Cr 含量略低于对照组，表明枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物及二者复合对鱼体肾功能无损伤作用。ALP 是一种非特异性表达的酶，也是机体生命活动的基础酶[21]。本试验中，枯草芽孢杆菌组、蒲公英提取物组及二者复合组ALP 活性与对照组均无显著性差异，这表明添加枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物以及二者复配物不会对鲤鱼机体健康带来不利影响。本试验研究结果表明，在日粮中添加枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物及二者复合均可明显提高鲤鱼LSZ 活性，从而增强机体非特异性免疫的功能，与前人研究结果[11]一致。AST、ALT 是反映肝功能的2 种重要指标[22]。本试验研究显示，在饲料中添加枯草芽孢杆菌和蒲公英提取物可显著降低鲤鱼AST、ALT。李树鹏等[23]研究发现，与对照组相比，黄芪多糖、益生菌和合生元组21 日龄和42 日龄雏鸡的AST 均下降。血清IgM、C3、C4 及LZM 是反映动物机体非特异性免疫功能的重要指标[24]。本试验结果表明，枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物可显著提高鲤鱼血清IgM 含量，表明其可增强鲤鱼的免疫功能；各试验组血清C3、C4 含量显著高于对照组。程远等[25]研究也发现，0.09%～0.18% 枯草芽孢杆菌组吉富罗非鱼幼鱼鱼血清C3 含量较对照组显著升高。

3.3 枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物对鲤鱼肝脏抗氧化功能的影响 抗氧化指标与动物机体健康程度、体内代谢、外界内氧自由基代胁迫环境的变化和免疫能力均具有密切相关性[3]。T-AOC 可作为抑制脂质过氧化产物形成能力的评价指标；SOD 活性与水生生物的免疫水平密切相关，对增强吞噬细胞防御能力和整个机体的免疫功能具有重要作用；CAT 可清除机体内超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤；DMA 是脂质过氧化物的主要分解产物，可反映细胞受损伤程度及脂质过氧化程度[26]。由于蒲公英提取物中含有绿原酸，可清除体内自由基[9]，而枯草芽孢杆菌作为一种良好的免疫激活剂，可有效增强机体免疫力，提高抗氧化活性[16]。赵倩等[14]采用枯草芽孢杆菌发酵中药制剂饲喂鲤鱼56 d，结果表明，试验组的T-AOC、SOD、CAT 均不同程度提高，FCR、MDA 含量不同程度降低；沈文英等[27]在饲料中添加枯草芽孢杆菌投喂草鱼，其血清T-AOC、SOD 和CAT 活性较对照组均显著提高，而试验组血清MDA 含量显著降低，表明枯草芽孢杆菌对草鱼抗氧化能力均有促进作用；本试验中，枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物及两者复合组鲤鱼血清 T-AOC、SOD、CAT、GST 及GSH-Px 活性较对照组显著增加，而MDA 活性显著下降，表明枯草芽孢杆菌、蒲公英提取物及两者复合可诱导机体氧化应激增强，饲料中添加枯草芽孢杆菌与蒲公英提取物可发挥协同作用，可为鱼类生长性能、免疫功能、抗氧化能力的研究提供理论依据，推测蒲公英提取物可能促进益生菌的增殖，而益生菌可以促进蒲公英提取物的吸收利用。关于芽孢杆菌与蒲公英提取物复合使用的作用机理还有待于进一步研究。

4 结 论

本试验结果表明，在日粮中添加枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物能明显促进鲤鱼WGR、提高FCR 及改善血液生化指标、增强抗氧化能力并提高其免疫功能，且枯草芽孢杆菌+蒲公英提取物复合使用比单一添加效果更好。由于益生菌与药食同源植物具有相互协同作用，不仅可以发挥益生菌的优势，又可提高药食同源植物的吸收率，因此二者复合作为饲料添加剂具有较好的发展前景。