LncRNA 在畜禽抗病育种中的研究进展

郭泽慧，兰 茜，李 祥，刘成利，黄勇富

（西南大学动物科学技术学院，重庆市牧草与草食家畜重点实验室，重庆市草食动物资源保护与利用工程技术研究中心，重庆 400715）

长期以来，疾病是影响畜禽业发展的重要因素，在生产过程中大多通过加强管理和使用药物等传统方法以短期解决畜禽疾病问题，但这不能从根本上控制和解决疾病的流行[1]，且长期使用药物会使机体产生耐药性，也无法完全确保药物在动物体内的残留状况。疾病的发生与遗传和环境有关，因此可以从遗传角度选择抗病性较高的个体，提高整体群体抗病力[2]。

抗病能力关乎畜禽的健康水平，是影响畜禽生长和繁殖的重要因素[3]。现今研究较多的是转基因技术和分子标记辅助选择（Marker Assisted Selection，MAS），两者从选择抗性基因出发，改良品种，可以有效地进行抗病育种[4]。虽然从转基因技术和分子育种等方面进行抗病选育可以在一定程度上改变畜禽的生长性能，但畜禽很多生物性状不仅发生在DNA 水平，也会受到mRNA 转录水平及翻译水平等影响，因此要考虑不同水平的影响，才能更加全面、准确地探究畜禽的抗病选育。长链非编码RNA（Long non-coding，LncRNA）是一种长度大于200 bp 且不具编码能力的RNA，LncRNA 可通过DNA 甲基化、基因组印记、组蛋白修饰等参与表观遗传及转录和转录后水平发挥调控作用，同时在机体的正常生长发育、细胞的增殖分化以及疾病的病变、癌症等方面也发挥重要作用[5]。研究发现，当LncRNA 表达异常时，一方面可通过调节邻近基因的表达参与宿主的抗病毒应答，另一方面可通过共表达的蛋白编码基因的表达进行功能调控，在抗病育种中发挥重要作用[6-7]。LncRNA 给畜禽的抗病育种提供了新的研究思路。

随着分子生物学、分子遗传学和基因工程技术的发展，抗病育种也将成为提高畜禽抗病力的重要手段。畜禽遗传改良工作者应将抗病性状列为遗传改良的目标性状之一，通过使用现代遗传学方法提高畜禽抗病力，加强畜禽机体免疫能力，来达到提高畜禽生产效率，促进畜禽业健康发展的终极目标。因此，本文综述畜禽抗病育种的现状及LncRNA 在畜禽疾病调控中的研究进展，揭示LncRNA 在畜禽抗病育种中的作用机制，以期为畜禽抗病育种工作提供一个新的视角。

1 LncRNA 调控作用机制

随着高通量测序技术不断发展，越来越多物种的基因图谱被解析出来，研究发现基因组序列中只有2%可编码蛋白，其余98% 的基因组序列不参与编码功能，产生非编码RNA（non-coding，ncRNA）。LncRNA 大多由RNA 聚合酶II 转录而来，存在于真核生物内，无开放阅读框，LncRNA 在一些癌症或肿瘤性疾病中发挥作用，在畜禽疾病研究中也具有重要功能[8]。

1.1 LncRNA 通过表观遗传学调控疾病发生过程 表观遗传学是指在基因序列不改变时基因表达可遗传的现象，其在生物体的发生和肿瘤的发生中起着重要作用，LncRNA 通过作为信号、诱饵、向导和支架等作用机制，与DNA、组蛋白修饰酶、异染色质蛋白等结合，参与表观遗传调控[9-10]。例如，LncRNA-CASC9 表达失调可以引起食管癌等多种疾病，CASC9 通过与CBP 结合并修饰组蛋白乙酰化而上调LAMC2 表达，该研究表明CASC9 可作为疾病的预后生物标记物[11]。H19 和Xist是最早被发现参与表观遗传调控的2 个LncRNA。Xist参与牛乳腺上皮细胞的炎性反应，研究表明Xist 抑制由大肠杆菌或金黄色葡萄球菌引起的NF-κB 通路的磷酸化，抑制炎症的发生，调节机体的免疫应答[12-13]。除此之外，在果蝇中，LncRNA-hsrω 与dFUS 蛋白相互作用，可以通过敲低LncRNA-hsrω 的表达来降低dFUS 表达，参与神经退行性疾病[14]。还有研究发现，大多数与疾病相关的LncRNA 利用染色质重塑结合招募特质的染色体复合物，进而影响机体调控[15]。例如，调控艾滋病病毒1 型（HIV-1）的LncRNA 招募含有DNMT3A这种脱氧核糖核酸甲基转移酶的表观重塑复合物，进而引起RNA 定向转录基因沉默，表明该LncRNA 可能参与了病毒潜伏期过程[16]。

1.2 LncRNA 通过转录水平调控疾病发生过程 转录水平的调控是LncRNA 参与基因调控的重要方式，在已知作用机制的LncRNA 中，大多数通过转录水平发挥调控作用。参与转录调控的LncRNA 可以与转录因子相互作用，激活或抑制下游基因的表达，也可与转录因子结合形成复合物调控邻近蛋白编码基因的表达，从而参与基因的转录过程[17]。例如LncRNAPvt1在白血病小鼠骨髓细胞中高表达，可通过转录因子MYC 发挥作用，而干扰Pvt1会引起骨髓分化表型[18]。另外，研究发现LncRNAMALAT1通过将转录因子Sp1 募集到启动子LTBP3 来促进上游基因LTBP3的转录，在多发性骨髓瘤起调控作用[19]。

1.3 LncRNA 通过转录后水平调控疾病发生过程 研究表明，定位在细胞质中的LncRNA 多通过参与转录后水平调控基因表达过程，主要通过调控RNA 的剪切、加工、拼接，参与翻译水平、调节蛋白活性以及通过竞争性内源RNA（Competing Endogenous RNAs，ceRNA）等发挥作用[20]。ceRNA 是RNA 间相互作用的一种新机制，已有很多LncRNA 通过ceRNA 调控靶基因的转录水平，如HSUR1、H19、CCAT1 等[21-23]。目前，ceRNA 在畜禽疾病中的研究相对较少，但同样发挥着重要作用。例如，针对会引起神经性疾病并使哺乳动物的脑细胞持续性感染的Boran 病毒（BODV）研究中，Sun 等[24]研究发现LncRNA 在不同的BODV 菌株中发挥不同的调控作用，ceRNA 作用分析表明ENSMUST00000128469可能与 miR-22-5p、miR-206-3p、miR-302b-5p、miR-302c-3p、miR-1a-3p 相互作用调控细胞增殖、病毒感染等过程。另外，在牛上的研究发现，H19 在牛乳腺炎上皮细胞炎症等疾病中发挥作用，H19 过表达可促进促炎因子表达，激活NF-κB 信号通路，影响脂多糖诱导的炎症性牛乳腺上皮细胞的免疫反应，表明H19 可能在调节牛乳腺上皮细胞免疫反应中起作用[22]。ceRNA 在人类肿瘤疾病中研究相对较多，如在人类肝癌发生过程中，Peng 等[23]检测肝癌组织和非肝癌组织中CCAT1 的表达，发现该LncRNA 在肝细胞癌组织中的表达明显高于非肝癌组织中的表达水平，找到了与CCAT1 特异性结合的let-7 的内源性靶点HMGA2 和c-myc，并发现CCAT1 与let-7 竞争性结合可以明显降低肝癌细胞的增殖和迁移。此外，有研究显示ceRNA 作用机制也在胃癌[25]、食管鳞状细胞癌[26]等癌症及其他人类疾病如糖尿病[27]、心血管疾病[28]等都发挥着重要的调控作用。了解LncRNA在人类疾病中的相关研究可为探究LncRNA 在畜禽疾病中如何发挥作用及抗病育种提供参考。

LncRNA 作为一种在不同生物学过程中发挥重要作用的调控因子，还可以通过与一些结合蛋白结合、在蛋白质翻译修饰后参与免疫反应[29]。例如，Li 等[30]研究表明 linc1992 THRIL 与hnRNPL 蛋白结合可调节肿瘤坏死因子的表达，说明在调控宿主与病原体的相互作用中发挥关键作用，参与机体先天免疫反应。

2 LncRNA 在抗病毒天然免疫反应中的作用

近年来，研究显示LncRNA 通过相关的免疫信号通路诱导下游相关基因进行调控，在宿主抗病毒免疫反应中起关键调控作用[31]。病毒感染宿主细胞后，一方面通过影响宿主中LncRNA 的表达以达到感染目的，使病毒得到繁殖；另一方面，病毒通过改变自身LncRNA 的表达来调控宿主的表达，达到隐性感染的目的，宿主细胞通过模式识别受体来识别病原相关模式分子，激活宿主天然免疫反应，诱导抗病毒因子产生，进而诱发抗病毒天然免疫反应[32]。在病毒感染中，越来越多的LncRNA 已被证明通过调控干扰素（IFN）在多种病毒感染和抗病毒感染中发挥作用，IFN 在免疫信号通路中被诱发产生，激活干扰素刺激基因（ISGs）的转录，进而影响病毒的复制与发生，诱发抗病毒反应[33]。Hu 等[34]研究发现由IFN 和肿瘤坏死因子（TNF）介导抗病毒信号通路诱导LncRNA 差异表达，进而调节宿主免疫反应，包括病原体识别受体（PRR）相关信号转导、转录因子的易位和活化、IFN 和细胞因子的产生、IFN激活的JAK-STAT 信号转导以及抗病毒干扰素刺激基因的转录。刘洋等[35]以小鼠为实验动物，用水疱性口炎病毒感染腹腔巨噬细胞，发现LncBC47 敲除可通过提高 IRF3 的磷酸化水平与Ⅰ型干扰素的产生来进行天然免疫应答，从而抑制水疱性口炎病毒感染。除IFN 以外，LncRNA 也可调节TNF、白介素（IL）、Toll 样受体等[36]细胞因子来影响天然免疫反应，进而引发宿主的抗病毒反应。

随着高通量测序技术的发展，通过转录组测序和生物信息学分析发现病毒感染引起的LncRNA 差异表达或失调，进而影响抗病毒反应，引起疾病发生（表1）。禽白血病[37]、马立克氏病[38]、猪蓝耳病[39]、猪脑心肌炎和水疱性口炎[40]等病毒是动物养殖过程中常见的病毒性疾病，会引起LncRNA 差异表达，参与抗病毒反应。禽白血病病毒和马立克氏病病毒会引起鸡的一些肿瘤性疾病，对鸡的生长发育产生较大影响。Lan 等[37]通过转录组测序发现了17 个差异表达的LncRNA，可能在禽白血病感染过程中发挥作用，其中LOC-009715被证明与干扰素因子相互作用，参与先天免疫反应。You 等[38]通过测序分析在脾脏组织中鉴定出了5 个差异表达的LncRNA，这些差异表达的LncRNA 与抗马立克氏病的候选基因高度相关。猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus，PDCoV）是一种新型的冠状病毒，会引起猪腹泻、呕吐等，Tang 等[41]在感染的不同时期共筛选出了173 个可能与猪德尔塔冠状病毒相关的差异表达的LncRNA。另外，在一些疾病相关研究中，研究者明确提出了LncRNA 表达与疾病的关系，例如在猪蓝耳病研究中，甘立鹏[39]发现LncRNA TCONS_00179042 表达上调与猪感染繁殖与呼吸综合征病毒有关。刘玮等[40]利用转录组测序检测发现LncRNA1 在猪脑心肌炎病毒、水疱性口炎病毒、单纯疱疹病毒感染过程中表达量降低，提示在动物机体感染病毒后，LncRNA1 特异性负调控I 型干扰素和促炎因子的产生。

表1 LncRNA 在动物抗病毒免疫反应中的研究

高通量测序的发展使研究者们发现了很多与疾病相关的LncRNA，也揭示了一些与抗病毒天然免疫反应的LncRNA，表明在动物机体被病毒感染后，先天免疫应答引起的LncRNA 变化有助于阐明宿主对病毒的防御机制，使研究者们进一步加深了对病毒发病机理的了解。但目前的研究鲜有说明这些LncRNA 在抗病毒天然免疫反应中的具体作用机制，因此LncRNA 在抗病毒反应中的如何发挥作用，在抗病育种中如何具体应用还需要进一步探究。

3 LncRNA 在抗菌反应中的免疫调控作用

LncRNA 除了在抗病毒免疫反应中具有调控作用外，其在调节宿主对细菌感染的免疫和炎症反应方面也发挥着重要作用。细菌是很多疾病的病原体，通过多种方式传播，如分枝杆菌[42]、大肠杆菌[43-45]、金黄色葡萄球菌[46]、产气荚膜梭菌[47]、沙门氏菌[48]等是生产养殖中常见的引起疾病的细菌，对动物健康造成很大影响。在养殖生产过程中，大多使用一些抗生素治疗细菌感染，但长期使用可能会使动物机体产生一定的耐药性，因此，进行疫苗研发或寻求新的治疗方法是急迫的。

研究发现，LncRNA 可能通过调节自噬控制炎症反应，对细胞抵抗细菌的能力产生影响[49]。如牛分枝杆菌感染巨噬细胞后，LncRNA MEG3 表达降低，进而抑制mTOR 和PI3K-AKT 信号传导诱导细胞自噬，消除分枝杆菌[42]。另外，LncRNA 还通过调控一些蛋白、参与炎症通路来参与疾病调控。奶牛乳腺炎是奶牛养殖过程中常见的一种炎症，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎常见的致原菌，有研究显示，奶牛乳腺上皮细胞发生炎症时，LRRC75A-AS1 高表达，引起LRRC75A-AS1 mRNA 表达升高，细胞紧密连接蛋白降低，细菌对细胞的黏附和侵袭能力明显升高，NF-κB 信号通路激活，从而参与乳腺上皮细胞的炎症反应，表明降低LRRC75A-AS1 的表达量可以缓解奶牛乳腺炎[43]。除此之外，还有研究表明LncRNA-TUB 也可能参与奶牛乳腺炎的发生，在炎症应答中发挥重要作用[46]。大肠杆菌种类多，除了可引起奶牛乳房炎外，也易引起动物肠道性疾病，如产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）易引起幼畜腹泻。以小鼠为实验动物的研究显示，ETEC 在感染小鼠后，LncRNA ENSMUST00000122226 可能参与调控ETEC 引起的炎症反应的发生[44]。大肠杆菌F7菌株是大肠杆菌的一个菌株，也会引起绵羊腹泻，黄赛男等[45]以服用大肠杆菌F7 菌株获得的腹泻型和非腹泻型绵羊肝脏组织为实验样本进行RNA-seq 测序，筛选得到34 个差异表达的LncRNA，分析发现这些LncRNA 富集到MAPK 信号通路、氧化磷酸化、绵羊甲状腺激素信号通路等9 个重要通路。RNA-seq 测序的发展和应用使更多在抗菌反应中发挥作用的LncRNA被发现，如Huang 等[47]研究了C 型产气荚膜梭菌感染仔猪后免疫应答中LncRNA 的调控作用，结果发现480 个差异表达LncRNA 和3369 个mRNA，可能通过PPAR 信号通路、趋化因子信号通路和Toll 样受体信号通路调节仔猪的免疫反应，抵御C 型产气荚膜梭菌感染。除此之外，该研究还发现差异表达的212 个LncRNA和505 个靶mRNA 与产气荚膜梭菌感染病相关，25 个LncRNA 和13 个靶mRNA 显示有抗细菌感染作用。

IFN 具有抗病毒、调节免疫的作用，LncRNA 通过IFN 在多种抗病毒感染中发挥作用，在抗菌反应中也进行调控。例如，沙门氏菌是一种常见的致病菌，存在一定的致病性，NeST 是一种基因间的LncRNA，研究发现NeST 通过表观遗传对干扰素-γ存在正向调节，具有抗肿瘤免疫特性[50]，参与沙门氏菌的调控。Gomez 等[48]研究证明NeST 通过促进小鼠体内IFN-γ的产生来促进沙门氏菌的清除；该研究也发现NEAT1/2 表达降低时机体易被沙门氏菌感染，揭示该LncRNA 的存在有助于宿主防御沙门氏菌感染。

细菌不仅在人类的生活中广泛存在并发挥作用，其对畜禽养殖的影响也不容忽视。已有研究发现了很多与畜禽抗菌反应相关的LncRNA（表2），这些LncRNA一方面可以通过调节自噬控制细菌反应，一方面可以通过调控蛋白发挥抗菌作用，通过测序分析获得了部分可能与抗菌反应相关的通路，但这些LncRNA 如何通过通路调控抗菌反应需要进一步研究。

表2 LncRNA 在动物抗菌反应中的研究

4 总结

畜禽疾病关系着国民经济效益以及人类食品安全，同时，对养殖业的长期健康发展影响颇大，因此对畜禽进行抗病选育研究显得尤为重要。近年来，LncRNA作用机制及功能研究受到越来越多研究者们的关注，LncRNA 已被证明通过多种调控形式介导免疫反应。近年来，随着现代测序技术和生物信息分析技术的发展，发现了很多参与抗病毒和抗菌反应的LncRNA，并揭示了LncRNA 与疾病间存在调控关系，预测了LncRNA与下游基因或通路的调控机制，证明LncRNA 在畜禽疾病过程中发挥了重要作用。但LncRNA 具体通过哪些通路或基因发挥抗病毒和抗菌反应，如何参与疾病的调控还不清楚。随着人们对LncRNA 的深入了解，将有更多的研究者通过筛选与疾病相关的LncRNA 并鉴定其功能进而挖掘出更多的LncRNA 作为畜禽抗病育种的遗传标记，为抗病育种的应用提供选育遗传位点，同时，有助于抗病育种在畜禽生态健康养殖中发挥重要作用。