不同保护剂对马鹿精液常温和低温保存效果的影响

李彦林，库尔班·吐拉克，金大智，杨 玮，吕杨茂

（新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052）

人工授精是马鹿保种及良种推广应用的重要手段，精液品质会影响马鹿的受胎率和仔鹿质量，所以精液保存尤为重要。在养鹿生产中，为充分利用优秀公鹿的遗传作用，需要将其精液保存下来并最大限度地延长精子的存活时间和受精能力。目前，鹿类精液保存多采用冷冻保存法，其人工授精受胎率较低，且多数稀释液配方成分复杂，使用效果差异较大[1-2]，关于鹿类精液常温保存及低温保存方面的研究报道较少。

研究表明，一定浓度的牛血清白蛋白（BSA）可以提高精子的生存能力[3]。另外，稀释液中添加动物源性蛋白（如卵黄）会提高精子感染风险[4]，选用大豆卵磷脂代替动物源性蛋白[5]可以降低精子感染风险并提高精子的生存能力。人工冬眠可降低机体对各种病理刺激的反应，有研究将冬眠合剂添加到精液低温保存稀释液中[6]。马鹿精液常温保存稀释液中添加BSA、大豆卵磷脂等能否延长其存活时间及低温保存稀释液中添加卵黄、冬眠合剂等能否延长其存活时间等一系列问题方面尚未见报。基于此，本实验以新疆伊河马鹿精液为研究对象，在精液保存稀释液中添加葡萄糖、蔗糖、BSA、大豆卵磷脂、卵黄及冬眠合剂等，探讨不同保护剂对马鹿精液常温及低温保存效果的影响，为提高马鹿配种效率及人工授精技术在马鹿养殖业中的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本实验于2020 年9—11 月在新疆昌吉盛华马鹿繁育基地进行，选用4～9 岁成年、健康的伊河马鹿公鹿15 头，采用单圈饲养。实验期间，马鹿由专人饲喂，精料由玉米、麸皮、棉蛋白、葵粕、棉粕等组成，日喂量为0.5～1 kg，粗饲料由青贮、苜蓿干草和麦秸组成，自由采食，并保证充足洁净的饮水。

1.2 精液的采集及质量检测

1.2.1 精液的采集及预处理 马鹿精液的采集采用麻醉保定电刺激采精法[7]。每次采集3 头公鹿精液并确保精液颜色和气味正常，精子活力达到0.8 以上的精液缓慢混匀，并用含有不同保护剂的稀释液按1 ∶5 的比例稀释，每隔4 h 检测精子的活力、顶体完整率、存活时间等。每个试验重复3 次。

1.2.2.1 精子活力的检测 用精子分析仪分析5 个视野下精子的活力。精子活力=（直线前进运动的精子/精子总数）×100%。

1.2.2.2 顶体完整率的测定 采用抹片法制作标本，观察精子顶体完整率。将制作好的抹片用姬姆萨染色液染色，在显微镜下放大400 倍观察精子形态，查数不同视野下100 个精子中所含的顶体完整精子数，计算精子的顶体完整率：顶体完整率=（顶体完整精子数/100）×100%。

1.2.2.3 存活时间的测定 存活时间的计算：精子存活时间是由第1 次检测精子活力开始计时至倒数第2 次检测精子活力所经历的时间，再加上最后1 次至倒数第2次检测精子活力所需时间的1/2。为此，对于倒数第1次和倒数第2 次精子存活时间的处理是采用折中的方法,以尽可能接近精子实际的存活时间。

1.3 实验设计

1.3.1 精液保存基础液的优化 在应用本实验室优化的马鹿精液冷冻保存基础液（由Tris、柠檬酸、葡萄糖、蔗糖、青链霉素等组成）中分别添加0.1%葡萄糖、0.1%蔗糖、0.1%葡萄糖+0.1%蔗糖，探讨基础液中的葡萄糖和蔗糖对马鹿精液保存的作用并优化基础液。

1.3.2 常温保存实验 在优化的基础稀释液中分别添加0、0.1%、0.2%、0.3% BSA，并常温（20 ℃）保存，筛选BSA 的最适添加浓度，然后在此基础上分别添加0.1%、0.2%、0.3%大豆卵磷脂，筛选出最优大豆卵磷脂浓度。

1.3.3 低温保存试验 经常温试验组所筛选出来的稀释液100 mL 中分别添加5%、10%、15%卵黄和1.25%、2.5%、5% 冬眠合剂，并低温（4℃）保存，分别筛选卵黄和冬眠合剂的最优试验组和最优浓度配比并比较两者的差异性。

1.4 统计分析 使用WPS 2019 软件对数据进行整理分析，数据的统计显著性实验检验使用IBM SPSS Statistics 25 软件中的单因素方差分析，P＜0.05 为差异显著，并采用Duncan's 方法对各组平均数进行多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同基础液对马鹿精液常温保存效果的影响 由表1 可知，在常温（20℃）条件下，各组精子活力随着保存时间的推移呈逐渐下降趋势，葡萄糖+蔗糖组的精子活力优于单一含葡萄糖和蔗糖组（P＞0.05），且精子能够保持60%以上活力的时间不足4 h。另外，马鹿精液分别在不同基础液中常温（20℃）条件下保存，精子存活时间由高到低为葡萄糖+蔗糖组＞蔗糖组＞葡萄糖组（P＞0.05）。

表1 不同基础液对马鹿精子活力及存活时间的影响（20℃）

2.2 BSA 对马鹿精液常温保存效果的影响

2.2.1 不同浓度BSA 对马鹿精子活力及存活时间的影响由表2 可知，在常温（20℃）保存条件下，保存24 h前添加BSA 组各时间点的精子活力均高于0%BSA 组（P＜0.05），且能够保持60% 以上精子活力的时间均为16 h（P＞0.05）；保存24 h 后0.2 %BSA 组各时间点的精子活力高于其他组（P＜0.05），且能够保持60%以上精子活力的时间可达24 h。另外，0.2 %BSA 组的精子存活时间最长，为75.33 h,高于其他3 组（P＞0.05）。

表2 不同浓度BSA 对马鹿精子活力及存活时间的影响（20℃）

2.2.2 不同浓度BSA 对马鹿精子顶体完整率的影响 由表3 可知，马鹿精液保存基础液中添加不同浓度BSA（0、0.1 %、0.2 %、0.3 %）并在常温（20℃）条件下保存，各组精子顶体完整率随着保存时间的推移逐渐下降趋势，其中浓度为0.2 %BSA 组略优于其他组（P＞0.05）。

表3 不同浓度BSA 对马鹿精子顶体完整率的影响（20℃） %

2.3 大豆卵磷脂对马鹿精液常温保存效果的影响

2.3.1 不同浓度大豆卵磷脂对马鹿精子活力及存活时间的影响 由表4 可知，在常温（20℃）保存条件下，保存24 h 前0.2 %大豆卵磷脂组在各时间点的精子活力略优于其他组（P＞0.05）；保存36 h 时0.2 %组和、0.3 %大豆卵磷脂组的精子活力高于0.1% 大豆卵磷脂组和对照组（P＜0.05），但0.2% 组和0.3 组无显著差异；0.2%大豆卵磷脂组保存48 h 时的精子活力高于其他组（P＜0.05），在60～72 h 极显著高于0.1%大豆卵磷脂组和对照组，且该组能够保持60% 以上精子活力的时间可达48 h。另外，0.2%、0.3%大豆卵磷脂组的精子存活时间高于其他2 组（P＜0.05），但0.2 %组和0.3 %组无显著差异。

表4 不同浓度大豆卵磷脂对马鹿精子活力及存活时间的影响（20℃）

2.3.2 不同浓度大豆卵磷脂对马鹿精子顶体完整率的影响 由表5 可知，在常温（20℃）条件下保存，各组精子顶体完整率随着保存时间的推移逐渐下降趋势，其中0.2 %大豆卵磷脂组略优于其他组（P＞0.05）。

表5 不同浓度大豆卵磷脂对马鹿精子顶体完整率的影响（20℃）

2.4 卵黄和冬眠合剂对马鹿精液低温保存效果的影响

2.4.1 卵黄和冬眠合剂对马鹿精子活力及存活时间的影响 由表6 可知，在低温（4℃）保存条件下，保存8 h前15%卵黄组在各时间点的精子活力高于5%、10%卵黄组（P＜0.05）以及对照组（P＜0.01）；12 h 后15%卵黄组在各时间点的精子活力高于其他组（P＜0.01），且能够保持60% 以上精子活力的时间可达16 h。15%卵黄组的精子存活时间最长（P＜0.01），为78 h。

表6 不同浓度卵黄对马鹿精子活力及存活时间的影响（4℃）

由表7 可知，在低温（4℃）保存条件下，保存16 h前5%冬眠合剂组各时间点的精子活力高于1.25%、2.5%组（P＜0.05）以及对照组（P＜0.01）；20 h 后5%组各时间点的精子活力高于其他组（P＜0.01），且能够保持60%以上精子活力的时间可达24 h。另外，5%冬眠合剂组的精子存活时间最长（P＜0.01），为84.67 h。

表7 不同浓度冬眠合剂对马鹿精子活力及存活时间的影响（4℃）

2.4.2 卵黄和冬眠合剂对马鹿精子顶体完整率的影响由表8 可知，马鹿精液保存稀释液中添加不同浓度卵黄（0、5%、10%、15%）并在低温（4℃）条件下保存，各组精子顶体完整率随着保存时间的推移逐渐下降趋势，其中15 %卵黄组略优于其他组（P＞0.05）。

表8 不同浓度卵黄对马鹿精子顶体完整率的影响（4℃）

由表9 可知，马鹿精液保存稀释液中添加不同浓度冬眠合剂（0、1.25 %、2.5%、5%）并在低温（4℃）条件下保存，各组精子顶体完整率随着保存时间的推移逐渐下降趋势，其中5 % 冬眠合剂组略优于其他组（P＞0.05）。

表9 不同浓度冬眠合剂对马鹿精子顶体完整率的影响（4℃）

3 讨 论

3.1 不同基础液对马鹿精液常温保存效果的影响 精子的存活和维持运动需要消耗能量，糖类作为能源物质，可为精子提供营养，补充精子能量。精子不能直接利用外界营养物质，而主要靠分解精子细胞内部的物质来获取能量[8]。葡萄糖能穿过精子质膜为精子代谢提供能量，蔗糖不能穿过精子质膜，但能调节渗透压，维持质膜稳定性，以利于精子存活[9]。本实验结果显示，基础液中同时添加葡萄糖和蔗糖对马鹿精子的保存效果略优于单一添加葡萄糖或蔗糖，这与曲宏伟等[10]的研究结果一致，这可能是与葡萄糖和蔗糖协同参与马鹿精子能量代谢过程有关，即葡萄糖穿透精子质膜为精子代谢提供能量，而蔗糖不穿透精子质膜但其调节精子细胞渗透压来维持精子质膜稳定性，从而延长精子的存活时间。有关葡萄糖和蔗糖怎样协同调节马鹿精子能量代谢过程有待进一步深入研究验证。

3.2 BSA 对马鹿精液常温保存效果的影响 BSA 通过清除离子和小分子来平衡精子质膜两侧的渗透压，并且阻止精子质膜与活性氧接触发生过氧化反应，有效地保护精子质膜[11]。Rachmawati 等[12]报道，添加不同浓度的BSA 作为牛精液冷冻保护剂，可防止精液在冷藏过程中冷休克，其中0.2%BSA 为最适浓度。本研究显示，马鹿精液在常温保存条件下稀释液中添加0.2%BSA 时精子活力的保持情况最好，说明BSA 可以提高马鹿精液的生存能力，这与库尔班·吐拉克等[7]的研究结果一致。此外，本研究表明在精液稀释液中添加0.2%BSA可有效延长马鹿精子的存活时间。在现有研究中，BSA的最适添加浓度有所差异，可能是由于不同稀释液和试验动物品种之间的差异性所导致。本研究发现，少量或过多的BSA 都不利于马鹿精子有效存活时间，说明少量的BSA 并不能起到马鹿精液保存的作用，过多则会损害马鹿精子，这与崔凯[13]研究结果一致。此外，BSA 对马鹿精子顶体完整率没有实质性的影响，这与刘玉等[14]研究结果一致，可能是BSA 通过稳定渗透压、保护细胞膜的作用来延长精子有效生存时间有关，BSA对马鹿精子顶体膜是否起到保护作用方面还得需要进一步深入研究。

3.3 大豆卵磷脂对马鹿精液常温保存效果的影响 稀释液中添加适量的大豆卵磷脂可以改善精子的保存效果，最佳添加浓度应考虑大豆卵磷脂纯度、基础液成分、试验动物等因素，有针对性的调整大豆卵磷脂浓度，从而得出试验动物精液稀释液中大豆卵磷脂的最佳浓度。本实验中，在常温条件下，马鹿精液稀释液中添加0.2%～0.3%大豆卵磷脂，马鹿精子的存活时间显著提高，而精子的顶体完整率与其他组没有显著变化，这与Akhter 等[15]研究结果相一致。近年来许多研究表明植物源性蛋白代替动物源性蛋白可以提高精液的保存效果，如等刘鑫[16]等发现在常规稀释液中添加0.6%大豆卵磷脂能显著提高猪精液4℃保存效果，Jessye 等[17]报道不含动物蛋白的稀释液可以降低低温保存的犀牛精液中禽类疾病传播的风险，因此探寻更多除大豆卵磷脂之外的非动物源性添加物来替代卵黄具有重要意义。

3.4 卵黄对马鹿精液低温保存效果的影响 精液稀释液中添加不同浓度的卵黄可以保护精子免受低温损伤，卵黄中的低密度脂蛋白聚集在精子膜表面，可有效减少精子的冷休克。曾嘉庆等[18]研究表明，卵黄中的脂蛋白通过参与精子细胞膜的加固、修补和扩增等作用，进而影响精子活率。在精液保存过程中，随着糖类营养物质的消耗，卵黄逐渐为精子代谢活动提供能量，进而延长了精液的保存时间，保护了顶体完整率，降低了随着时间推移精液中产生的有害物质（如代谢废物、细菌以及一些活性氧对精子）的损害作用[19]。本实验表明，稀释液中添加15%卵黄可以提高低温（4℃）保存下马鹿精子活力，并延长精子存活时间，这与张柳明等[20]的研究结果一致。这可能是与卵黄中的低密度脂蛋白聚集在马鹿精子膜表面有效减少精子的冷休克有关。

3.5 冬眠合剂对马鹿精液低温保存效果的影响 已有报道称人工合成的冬眠合剂有利于精液低温保存[6]。本研究中，马鹿精子在低温（4℃）条件下保存，当冬眠合剂添加到5%时，马鹿精子的活力和存活时间均极显著提高，但精子的顶体完整率没有显著变化。这可能是冬眠合剂增强马鹿精子质膜抗氧化能力，降低精子过氧化损伤，从而延长了精子保存时间，另外冬眠合剂中的氯丙嗪是钙调蛋白抑制剂，有效降低精子对钙离子的反应，减少其能量消耗，从而延长其保存时间。但精子顶体完整率很可能不受冬眠合剂的影响，有关此方面仍需要进一步深入研究验证。另外，本实验设计的冬眠合剂最高浓度为5 %条件下，马鹿精子活力及存活时间极显著高于其他组，基于更高浓度的冬眠合剂是否更有利于马鹿精子低温保存，有待于进一步实验。本实验用到的冬眠合剂主要成分为氯丙嗪和异丙嗪，均属于吩噻嗪类药物。由于吩噻嗪核极易被氧化，表现出很强的细胞抗氧化能力[21]，因此氯丙嗪和异丙嗪可以通过降低精子的过氧化损伤，增加精子保存时间和存活率。已有研究表明，氯丙嗪和异丙嗪通过改变葡萄糖代谢[22]和抑制葡萄糖摄取[23]来抑制细胞被氧化。基于氯丙嗪和异丙嗪是否参与马鹿精子葡萄糖代谢过程有待进一步深入研究。

4 结 论

本实验结果显示，基础稀释液中同时等量添加0.1%葡萄糖和蔗糖、常温保存稀释液中添加0.2% BSA 和0.2%大豆卵磷脂、低温保存稀释液中添加15%卵黄和5%冬眠合剂有利于马鹿精液的保存。

致谢：本实验得到了新疆昌吉市盛华马鹿繁育基地及工作人员的大力支持和帮助，为此表示感谢。