雉鸡肌纤维和肉质性状及其与ATIC、AMPD1和CAPN1 基因表达相关性分析

吴 琼，李 焰*，袁红艳，沈欣悦，杨胜优

（1.龙岩学院生命科学学院，福建龙岩 364012；2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海 201499）

我国是世界上养殖雉鸡最早的国家，人工养殖历史久远，根据史书记载，4 000 年前甲骨文中就有“雉”字记载。明朝李时珍的《本草纲目》将雉鸡列为“原禽类”，对雉鸡的药用价值做过记述[1-2]。新中国成立后雉鸡养殖业开始发展，20 世纪80 年代末期我国从国外引进了中国环颈雉（美国七彩雉鸡）、白羽雉鸡和黑化雉鸡（孔雀蓝雉鸡）等，同时成功驯化了河北亚种雉鸡，在此基础上培育了左家雉鸡，并开始了大规模的人工繁殖。2019 年培育出我国首个国审雉鸡新品种“申鸿七彩雉鸡”。目前，上海、广州等地区已形成雉鸡规模化、集约化生产，养殖种类主要为中国环颈雉、黑化雉鸡和申鸿七彩雉鸡，部分品种为天峨六画山鸡、蒙古雉鸡、绿雉鸡和白羽雉鸡[3]。

肌苷酸（Inosinemonphosphate，IMP）是一种在核糖核酸中发现的核苷酸，在畜禽及鱼肉中含量较高，所以IMP 含量可以用来评定肉质风味[4]。次黄嘌呤核苷酸环水解酶基因（ATIC）和腺苷一磷酸脱氨酶基因（AMPD）表达与IMP 含量密切相关[4-5]。钙蛋白酶（CAPNs）是细胞内钙离子依赖性半胱氨酸蛋白酶家族，钙蛋白酶1（CAPN1）是此家族的重要成员之一[6]。Felicio 等[7]研究证明，鸡CAPN基因与肌纤维组成和生长性状显著关联。尽管ATIC、AMPD和CAPN1基因在嫩度调控及肉风味改善中发挥着重要作用，但国内外尚没有关于ATIC、AMPD和CAPN1基因表达与雉鸡肌肉性状相关性的研究，为此，本研究旨在对中国环颈雉、蒙古雉鸡、黑化雉鸡、申鸿七彩雉鸡和绿雉鸡的肌纤维特性和肉质性状与ATIC、AMPD1和CAPN1基因相关性进行研究，以期为进一步研究ATIC、AMPD1和CAPN1基因功能和选育雉鸡新品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 分别选取相同出雏时间、同一饲料和饲养环境下的中国环颈雉、蒙古雉鸡、绿雉鸡、申鸿七彩雉鸡和黑化雉鸡母鸡100 只，每个品种各20 只，育雏期后进行笼养，饲养至成龄（18 周龄）进行屠宰，屠宰方式为舌下放血。每个品种选择5 只鸡，在无菌条件下分别采集左侧胸肌组织，采样后立即投入液氮中，并尽快转移至-80℃保存，用于基因表达的分析；每个品种均取右侧相同部位的新鲜胸肌（1 cm×1 cm×0.5 cm）放入10% 的福尔马林溶液中，用于石蜡切片的制作，剩余胸肌用于肌肉品质性状测定。

1.2 实验方法

1.2.1 肌纤维特性测定 使用OLYMPUS 荧光显微镜的测微尺在400 倍视野下进行观察和测量，胸肌组织各观察10～12 个切片，选取5 个视野，测量20 根肌纤维直径，总计测量100 根肌纤维直径，计算平均值，即为所测量胸肌组织样品的肌纤维直径数据。观察的切片随机选取5 个视野，计算肌纤维根数，计算平均值后，即为胸肌组织样品所测肌肉的肌纤维密度。

1.2.2 肌肉品质性状测定 肌肉剪切力采用肌肉嫩度仪（C-LM 3B，东北农业大学）测量，肉色采用color meter 色差仪（CR-10plus，日本柯尼卡美能达有限公司）、pH 值采用酸度计（S2-Food kit，瑞士梅特勒-托利国际多国际股份有限公司）测定。

1.2.3 组织总RNA 提取和cDNA 合成 将所采集胸肌样品使用RNAiso Plus 试剂盒（TaKaRa，大连宝生物有限公司）提取总RNA，利用1%琼脂糖凝胶电泳进行RNA 检测，利用酶标仪检测RNA 浓度。以不同雉鸡品种胸肌总RNA 为模板，利用反转录试剂盒（TaKaRa，大连宝生物有限公司）进行反转录，合成cDNA。

1.2.4 引物设计与合成 利用Primer 5.0 和oligo 7.0 软件进行引物设计和评估。所有引物均由上海生物工程技术有限公司合成。目的基因和内参基因引物序列信息见表1。

表1 引物序列信息表

1.2.5 目的基因mRNA 相对表达量测定 使用SYBR GreenI 实时荧光定量PCR 试剂盒（TaKaRa，大连宝生物有限公司），具体操作按照试剂盒说明书进行，利用荧光定量PCR 仪（美国ABI 7500）进行基因相对表达量测定，每个样品3 个重复，设定无cDNA 样品作为阴性对照。20 μL 反应体系为：SYBR Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物（10 μM）各1 μL，ROX Reference Dye（50×）0.4 μL，模 板cDNA（10×diluted）2 μL，灭菌双蒸水5.6 μL。反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性15 s，58℃退火30 s，40 个循环，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，60℃ 15 s。

1.3 统计分析 本实验所测数据利用SAS 10.0 软件进行显著性检验分析。所有数据均用“平均数±标准差”表示。

2 结果

2.1 雉鸡肌肉的组织学特性 由表2 可知，雉鸡胸肌肌纤维直径为蒙古雉鸡＞中国环颈雉＞黑化雉鸡＞绿雉鸡＞申鸿七彩雉鸡，蒙古雉鸡胸肌纤维直径显著高于其他雉鸡，中国环颈雉与绿雉鸡和黑化雉鸡差异不显著。肌纤维密度为绿雉鸡＞申鸿七彩雉鸡＞中国环颈雉＞黑化雉鸡＞蒙古雉鸡，绿雉鸡显著高于其他雉鸡，中国环颈雉与申鸿七彩雉鸡肌纤维密度差异不显著，蒙古雉鸡胸肌肌纤维密度最低。

表2 雉鸡胸肌纤维直径和密度测定结果

2.2 雉鸡肌肉的品质性状 由表3 可知，5 种雉鸡胸肌剪切力、失水率、pH、肌肉红度值（a）、肌肉黄度值（b）和肌肉亮度值（L）均差异不显著。

表3 雉鸡胸肌纤维直径和密度测定结果

2.2 目的基因在不同雉鸡品种中的相对表达量 如图1所示，ATIC、AMPD1和CAPN1基因在中国环颈雉、蒙古雉鸡、绿雉鸡、申鸿七彩雉鸡和黑化雉鸡胸肌中均有表达，ATIC基因表达量大小依次为申鸿七彩雉鸡＞蒙古雉鸡＞绿雉鸡＞中国环颈雉＞黑化雉鸡，申鸿七彩雉鸡ATIC基因的表达量与中国环颈雉和黑化雉鸡差异显著，与蒙古雉鸡和绿雉鸡差异不显著；AMPD1基因表达量大小依次为申鸿七彩雉鸡＞蒙古雉鸡＞绿雉鸡＞黑化雉鸡＞中国环颈雉，申鸿七彩雉鸡与其他雉鸡均差异显著。蒙古雉鸡与绿雉鸡、中国环颈雉与黑化雉鸡之间差异不显著；CAPN1基因表达量大小为蒙古雉鸡＞ 绿雉鸡＞申鸿七彩雉鸡＞中国环颈雉＞黑化雉鸡，蒙古雉鸡与绿雉鸡和申鸿七彩雉鸡差异不显著，与中国环颈雉和黑化雉鸡差异显著。

图1 不同品种雉鸡ATIC、AMPD1 和CAPN1 基因表达变化图

2.3 雉鸡ATIC、AMPD1和CAPN1基因表达量与肌肉品质性状相关性

2.3.1 雉鸡ATIC基因表达量与肉质性状相关性 由表4可知，中国环颈雉ATIC基因表达量与肌肉pH 之间存在极显著正相关；蒙古雉鸡ATIC基因表达量与失水率之间呈显著正相关；绿雉鸡ATIC基因表达量与肌纤维直径之间存在极显著正相关；申鸿七彩雉鸡ATIC基因表达量与肌肉L 值之间呈显著正相关；黑化雉鸡ATIC基因表达量与肌肉a 值之间呈极显著正相关。说明不同雉鸡品种ATIC基因表达量与肉质性状的相关性存在差异。

表4 雉鸡ATIC 基因表达量与肌纤维特性和肌肉品质性状相关性分析

2.3.2 雉鸡AMPD1基因表达量与肉质性状相关性 由表5 可知，中国环颈雉AMPD1基因表达量与失水率之间呈极显著正相关；蒙古雉鸡AMPD1基因表达量与肌肉a 值之间呈显著负相关；绿雉鸡与肌肉性状之间无相关性；申鸿七彩雉鸡AMPD1基因表达量与失水率和肌肉b 值之间呈显著正相关；黑化雉鸡AMPD1基因表达量与肌肉a 值之间呈显著正相关。

表5 雉鸡AMPD1 基因表达量与肌纤维特性和肌肉品质性状相关性分析

2.3.3 雉鸡CAPN1基因表达量与肉质性状相关性 由表6 可知，中国环颈雉、蒙古雉鸡和黑雉鸡CAPN1基因表达量与肌纤维直径之间呈显著正相关；绿雉鸡CAPN1基因表达量与肌纤维直径和失水率之间呈极显著正相关；申鸿七彩雉鸡CAPN1基因表达量与肌纤维直径之间呈极显著正相关，与pH 之间呈显著正相关，与失水率之间呈显著负相关。与肌肉L 值之间呈显著正相关；绿雉鸡CAPN1基因表达量与肌纤维直径和失水率之间呈极显著正相关，申鸿七彩雉鸡CAPN1基因表达量与pH 之间呈显著正相关，与失水率之间呈显著负相关，黑化雉鸡CAPN1基因表达量与肌肉a 值之间呈显著正相关，与肌肉b 值之间呈显著负相关。

表6 雉鸡CAPN1 基因表达量与肌纤维特性和肌肉品质性状相关性分析

3 讨 论

肌肉纤维是构成肌肉组织的重要组成部分。动物肌肉组织的生长主要是卫星细胞的增殖分化，使得肌肉纤维变长变粗，不依赖于肌肉纤维数量的增加[8]。动物肌肉体积的增加是肌纤维体积增大导致，随着动物肌肉纤维的逐渐变粗，肌肉之间的结缔组织与脂肪数量也会逐渐增加，从而导致肌纤维密度下降。鸟类动物肌纤维数量在出生后会相对稳定，保持不变[9]。国内外学者研究表明，肌纤维直径和肌纤维密度与肉质性状密切相关[10]。吴信生等[11]、杨烨等[12]和陈洁波等[13]分别对鸡肉肌纤维和肉品质性状相关性进行研究，发现肌纤维越细，肉质嫩度就越好，两者呈负相关性，主要原因为肌纤维较粗时，肌原纤维之间结合就会越牢固，所以肌肉剪切力会变大，嫩度就会越差。目前，肌纤维指标已经成为衡量产肉动物肉品质优劣的重要指标。影响动物肌纤维的因素很多，有动物年龄、体重增长速度、营养供给和运动量等，动物年龄越大，肌纤维会越粗，体重增长速度越快，动物肌纤维的增粗速度也会加快，因此动物日增重比较快，其肌肉嫩度会相应下降。在养殖过程中，需要找到动物生长速度和肉品质之间的平衡点[14]。

国内外还未见雉鸡肌纤维直径和密度的相关研究报道，本研究通过对我国家养中国环颈雉、蒙古雉鸡、绿雉鸡、申鸿七彩雉鸡肌纤维特性测定结果分析可知，申鸿七彩雉鸡胸肌和腿肌肌纤维直径最小，肌纤维密度胸肌低于绿雉鸡，腿肌低于蒙古雉鸡，但均高于其他雉鸡。申鸿七彩雉鸡为我国多年人工选育适应笼养的雉鸡新品种，而中国环颈雉、蒙古雉鸡、绿雉鸡和黑化雉鸡均为国外引入品种，在国外养殖多为狩猎使用，推测选种目标不同导致其肉嫩度存在差异。

本研究中ATIC、AMPD1和CAPN1基因在中国环颈雉、蒙古雉鸡、绿雉鸡、申鸿七彩雉鸡和黑化雉鸡胸肌均有表达，这与吴琼[4]对中国环颈雉ATIC基因相对表达量研究结果一致，雉鸡AMPD1和CAPN1基因相对表达量的研究国内外还未见报道，但与于平[15]和高海军[16]对鸡的研究结果一致。ATIC和AMPD1基因在申鸿七彩雉鸡中表达量最高，推测可能因为申鸿七彩雉鸡为人工选育品种，其表达量与品种有关，但其表达模式是否为其所特有，能否作为影响其肉质性状的候选基因，还需进一步研究证实。本研究中雉鸡CAPN1基因表达量与肌纤维直径呈显著正相关，这与Zhang 等[17]发现鸡CAPN1基因的表达量与肌纤维直径显著关联的结果基本一致。由此可见，ATIC、AMPD1和CAPN1基因与雉鸡肌纤维和肉质性状存在一定相关性，但具体机制还需进一步实验证实。

4 结 论

不同品种雉鸡肌纤维组织学特性和肉质性状存在差异，雉鸡ATIC、AMPD1和CAPN1基因在不同雉鸡胸肌中均有表达，相对表达量对肉质的影响存在差异。因此，对雉鸡肉质相关候选基因表达规律与肉质相关性的研究将为我国雉鸡资源进一步开发利用提供一定的理论依据。