多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白对尖孢炭疽病菌的抑制作用

田 歌，韩玉虎，Gregori R，周柏玲

（1.山西农业大学功能食品研究院，山西太原030031；2.山西农业大学果树研究所，山西太原030031；3.加州大学植物科学系，美国加州戴维斯95616）

在果实的病理性软化过程中，病原真菌的水解酶导致果实的细胞壁降解和软化，同时，果实会发生应激反应以抵御病原菌的入侵。如多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase-inhibiting protein，PGIP）[1]与病原真菌内源多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）形成一种高亲和复合物，从而抑制endo-PG的部分活性[2]，减少对植物细胞壁的降解，减缓病原真菌的生长繁殖速度。有关PGIP的结构、性质、功能等方面国内外学者已进行了广泛、深入的研究[3]。PGIP是一种含有富亮氨酸重复区域的蛋白质，能够抑制多种真菌的多聚半乳糖醛酸酶的活性，干扰灰霉菌等多种真菌病害对植物组织的侵染过程，从而抑制真菌病害的发生。但有关苹果PGIP抑制尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）的研究报道较少。

丹霞苹果是山西省农业科学院自主选育的晚熟苹果新品种，具有易成花、早丰产、品质优、易管理等优良特性，其独特风味和浓郁香气深受果农和消费者的青睐，在山西大规模栽种，也是华北、西北苹果主产区的主栽品种之一[4]。但在果实采后贮藏中后期，由尖孢炭疽菌侵染致丹霞苹果软腐病发生严重，给果农带来重大损失。

本试验在前人有关PGIP研究的基础上，从丹霞苹果果实病斑提取、筛选、培养尖孢炭疽菌，测定尖孢炭疽菌病菌活性，同时从丹霞果实健康组织中提取PGIP，检测PGIP对尖孢炭疽菌水解酶半乳糖醛酸酶（PG）的抑制作用，从细胞水平研究丹霞苹果自身所具备的抑制尖孢炭疽菌感染的抗病因子，探索预防尖孢炭疽菌感染的新思路，旨在为防治苹果软腐病提供新途径。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试苹果品种丹霞由山西省农业科学院果树研究所选育，成熟期收获后在4℃下贮藏。

改良普拉特培养基（PM）[5]包含:13.6 g KH2PO4，4 g NH4NO3，1.25 g MgSO4·7H2O，0.02 g FeSO4·7H2O，0.001 g CuSO4·5H2O，0.002 g ZnSO4·7H2O，0.001 3 g（NH4）2MoO4，0.016 g MnSO4·H2O，0.028 g H3BO3，定容至1 L。

马铃薯葡萄糖培养基（PDA）购自美国西格玛公司。

1.2 试验方法

1.2.1 尖孢炭疽菌分生孢子悬浮液的制备 从苹果的感染组织中分离出尖孢炭疽菌，并在PDA上培养10 d，然后用无菌蒸馏水冲洗菌落制备病原菌分生孢子悬浮液，浓度为1×103个/mL。

1.2.2 尖孢炭疽菌的液体培养 用1 mol/L盐酸将PM培养基pH值调节至4.5，取9 mL培养基分装到15 mL试管中，而后在121℃下高压灭菌15 min。每个试管加入1 mL（浓度为1×103个/mL）尖孢炭疽菌的分生孢子悬浮液接种。在20℃下摇培14 d。

1.2.3 尖孢炭疽菌分泌蛋白质（PECA）提取 将尖孢炭疽菌的培养液离心（13 000×g，30 min），回收上清液（约5 mL）并添加1 mL缓冲液（0.05 mol/L NaCl和0.1 mol/L乙酸钠，pH值5），再次离心（13 000×g，30 min）。收集上清液并过滤2次：第1次用微孔玻璃过滤器（密理博），第2次用微孔膜过滤器（0.45 μm）。将滤液用透析膜管（6.000-8.000 MWCO，Spectrapor）透析过夜（4℃，0.1 mol/L乙酸钠，pH值5），从PM中提取的尖孢炭疽菌蛋白质在4℃下储存至使用[5]。试验设置3个重复。

1.2.4 苹果健康组织蛋白质（PEHT）提取 取6 g丹霞苹果果实，在缓冲液（50 mmol/L乙酸钠，pH值5，1%聚乙烯吡咯烷酮和1 mol/L NaCl）中均质提取蛋白质[6]。在4℃下匀浆1 h后在4℃下13 000×g离心5 min，并按1.2.3进行过滤、透析和浓缩。蛋白质提取物（PEHT）在4℃下储存，次日使用[7]。

1.2.5 多聚半乳糖醛酸酶的活性分析

1.2.5.1 琼脂糖径向扩散法 将1.5 g琼脂糖、10 mg多聚半乳糖醛酸（PGA，Fluka）和0.365 g乙二胺四乙酸加入150 mL0.1 mol/L醋酸钠缓冲液（pH值5），加热溶解，倒入23 cm×23 cm有机玻璃框中，冷却凝固后使用[8]。

用软木钻在琼脂片上打直径为4 mm的孔。每孔加样15 μL（PECA和PEHT），并在37℃下培养过夜。用钌红（0.05%（m/V），Fluka）染色，用样孔周围未染色（区域晕）面积来评估多聚半乳糖醛酸酶的活性。以黑曲霉的果胶酶（Sigma）作为标准多聚半乳糖醛酸酶阳性对照[9]，水和0.1 mol/L醋酸钠缓冲液（pH值5）为阴性对照。每样3个重复。

1.2.5.2 分光光度法 反应混合物（Reaction Mixture，RM）的制备：将50 μLPECA加入3 mL0.1%PGA和3 mL乙酸钠缓冲液（0.05 mol/L，pH值5）中，在30℃水浴中孵育反应，添加苹果健康组织蛋白质（PEHT）提取物进行消化。在0（添加酶后立即）～28 h的不同时间间隔内，每隔2 h取200 μL的RM等分样品，添加1 mL 0.1 mol/L硼酸钠（pH值9.6）中止反应。然后分别添加300 μL的1%2-氰基乙酰胺试剂溶液，煮沸10 min后在276 mm处测量吸光度（岛津UV-2401PC）。以半乳糖醛酸不加PECA和PEHT为标准曲线[10]。

1.2.6 PGIP抑制活性的测定 取7.5 μL尖孢炭疽菌分泌的蛋白质（PECA）分别添加在醋酸缓冲液稀释（Ⅰ）、煮沸PEHT（Ⅱ）、新鲜PEHT（Ⅲ），以热失活PEHT作为阴性对照。每个处理设置3个重复。

1.2.7 尖孢炭疽菌的接种试验 用不锈钢刀在丹霞苹果中部划口（3 mm×3 mm×3 mm），在伤口处接种20 μL尖孢炭疽菌分生孢子悬浮液[11]。室温下静置1 h，在伤口处注入等量的蒸馏水（尖孢炭疽菌＋H2O）、醋酸盐缓冲液（尖孢炭疽菌＋buffer，0.1 mol/L，pH值5）、PEHT（尖孢炭疽菌＋PEHT），分别用蒸馏水（H2O＋H2O）和PEHT（PEHT＋H2O）处理的果实作阴性对照和阳性对照。

接种处理后，将试样放在20℃和相对湿度较高的环境下，每个处理2个重复（第1年、第2年）。接种后第4天开始记录病斑面积（mm2），连续记录7 d。然后计算PEHT抑制尖孢炭疽菌病斑面积的缩小程度。

1.3 数据分析

所有数据均进行单因素方差分析。采用Fisher's LSD检验分离平均值（P≤0.05）。使用统计软件包Statistica for windows处理数据。数据分析前，用Bartlett检验进行方差显著性检验。

2 结果与分析

2.1 尖孢炭疽菌中多聚半乳糖醛酸酶活性检测

琼脂糖径向扩散分析结果显示（图1），在加载尖孢炭疽菌的样孔周围有一个清晰的区域（光晕）（孔3），阴性对照组（缓冲液和水）或健康组织的蛋白质提取物PEHT中未观察到活性，表明尖孢炭疽菌中多聚半乳糖醛酸酶活性良好[10]。

分光光度检测结果显示，尖孢炭疽菌的多聚半乳糖醛酸酶在28 h内基本完成消化，并且在培养8～20 h期间表现高度线性相关（R2＝0.995 6）。根据16 h的测定结果，酶活性为3.2×104μg/（mg·h）（图2）。进一步验证了尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性良好。

2.2 丹霞苹果蛋白提取物PEHT对尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶PG的抑制

在尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性良好的情况下，添加从健康丹霞苹果中提取的蛋白质PEHT，反应结果在琼脂糖径向扩散分析显示，光晕明显缩小（超过65%）（P≤0.001 9）（图3），表明PEHT对尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶的活性有明显的抑制作用。

2.3 PGIP抑制尖孢炭疽菌接种试验

在新鲜丹霞果实上接种尖孢炭疽菌，结果显示，接种4 d后所有果实均出现腐烂，第4天和第10天的病斑面积分别为36.01、861.32 mm2（表1，第1年）。然而，在接种伤口处添加PEHT，对尖孢炭疽菌的侵染产生了明显的抑制作用。在接种初期，PGIP对尖孢炭疽菌的抑制性很强，接种后第4天，抑制率可达到54.5%。随着接种时间的延长，PGIP对尖孢炭疽菌的抑制性逐渐降低，接种后第10天抑制率降为27.9%（表2，第1年）。第2年结果与第1年结果相似。综上所述，在PEHT中存在抑制尖孢炭疽菌半乳糖醛酸酶活性的PGIP。

表1 丹霞苹果蛋白提取物（PEHT）对尖孢炭疽病的抑制作用

表2 PGIP对尖孢炭疽菌的抑制率 %

3 结论与讨论

前人研究报道了PGIP存在于柑橘[12]、葡萄柚[13]和豆类[14]中，表明其具有抗病特性。PARK等[15]研究发现，多聚半乳糖醛酸酶活性与衰变的严重程度与病斑直径呈正相关，表明这种酶在病害发展过程中作为一种毒力因子发挥作用。在番茄[16]、苹果[17]和覆盆子[18]等物种中，PGIP主要在果实组织中表达，而在豆类等物种中，PGIP可在植物的营养体部分和其他组织中表达[19]。

在本试验中，针对丹霞苹果果实易染尖孢炭疽菌的特点，通过检测丹霞苹果果实PGIP对尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性的抑制试验和接种试验，探明丹霞苹果果实内部具有抑制尖孢炭疽菌多聚半乳糖醛酸酶活性的PGIP蛋白，并对尖孢炭疽菌的侵染具有抑制作用。

前人研究表明，外源PGIP基因的引入增强了柿子对灰霉病菌的抗病性[20]，并且POWELL等[8]在实验室发现，转PGIP基因的番茄植株中灰霉病有所减少。本研究表明，PGIP在丹霞苹果果实抵抗尖孢炭疽菌侵入方面有潜在防御作用。深入研究苹果果实中PGIP抗病活性成分及抗病机制以及应用生物技术和基因工程技术人工调控苹果PGIP水平，最大限度抑制由尖孢炭疽菌导致的果实腐烂，为农作物真菌病害的防控奠定基础。