7.0T MR-DTI评估大鼠脑胶质瘤瘤周浸润组织各向异性分数及纤维密度指数与皮质脊髓束损伤分级的相关性研究

贾晓雄，张国斌，夏鹤春(通信作者)

1 天津市环湖医院神经外科 (天津 300350)；2 天津市颅脑损伤抢救中心 (天津 300350)；3 宁夏医科大学总医院神经外科 (宁夏银川 750001)；4 宁夏颅脑疾病国家重点实验室(宁夏银川 750001)

胶质瘤侵袭性生长对神经系统的破坏大多表现为对白质纤维束的侵袭,对于涉及皮质脊髓束的胶质瘤，神经功能障碍往往是由于运动传导束的破坏、推挤或者变形[1-3]。因此，评估皮质脊髓束不同损伤程度能够为制定更好的神经治疗策略提供有价值的信息。

弥散张量成像(diffusion tensor imaging，DTI)已经被证实可以区分纤维束的损伤程度并且用于量化分析皮质脊髓束的侵袭程度。有学者已经证实各向异性分数(fractional anisotropy，FA)在靠近肿瘤侧白质区域是降低的，在瘤周区域，FA较低，证明FA在瘤周区域受到病变的影响[4-6]。纤维密度指数(fiber density index，FDi)是用于显示纤维束上一个单位体积的纤维束密度，可以提供有效的信息评估肿瘤的边界区域和瘤周区域白质纤维束的分布[7-9]。纤维束示踪成像(diffusion tensor tractography，DTT)是无创的，通过在纤维束行进区域设置3D感兴趣区来可视化显示白质纤维束的技术，可以显示出特定的纤维传导束[4]。此外，肿瘤细胞增殖和侵袭能够导致皮质脊髓束的破坏，而破坏的程度可以反映它的生物学行为[10]。

DTI能够评估纤维束的损伤程度，并且被用于患者神经功能检测评估。然而，就我们所知目前少有报道将相对各向异性分数(relative fractional anisotropy，rFA)和相对纤维密度指数(relative fiber density index，rFDi)作为DTI量化参数指标应用于脑胶质瘤影响下的皮质脊髓束损伤程度分类中，并且与大鼠胶质瘤病理结果评估相结合。

因此，在本研究中，我们建立大鼠脑胶质瘤模型并选取瘤周浸润区域感兴趣区，测量瘤周区域和健侧相对应区域FA和FDi，并计算rFA和rFDi。此外，大鼠处死后行病理检测，评估瘤周区域肿瘤细胞浸润与DTI参数分析纤维束损伤程度的相关性。

1 材料与方法

1.1大鼠脑胶质瘤模型建立

本研究选用C6细胞系，SD大鼠14只，均为成年雄性，体质量约0.25 kg。C6细胞系用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养，后建立大鼠脑胶质瘤模型，具体操作步骤及方式详见前期已发表文章[11-12]。动物研究相关步骤经过宁夏医科大学总医院伦理委员会审批并同意。

1.2小动物磁共振扫描

磁共振扫描时间点为建模后第10天，扫描结束后处死大鼠行病理检查。本研究采用7.0T磁共振扫描仪(Bruker BioSpec 70/30 USR，德国)，成像线圈选择小动物专用线圈，麻醉使用小动物呼吸麻醉机(MATRX VIP3000，美国)实时麻醉，监护采用小动物监护/门控系统(SAⅡ Model 1030，美国)记录大鼠呼吸、心电、体温；麻醉后迅速将大鼠放入磁共振扫描床使用大鼠专用牙杆及呼吸面罩进行持续气体吸入；扫描过程中监测大鼠呼吸、心电、体温，扫描期间利用循环加热垫维持大鼠温度。

T1扫描采用加权快速自旋回波(RARE)序列，采集11层大鼠头颅冠状位图像，扫描参数为，TR=1 500 ms，TE=6.5 ms，FOV=20 mm×20 mm，扫描层厚为0.5 mm，矩阵为256×256，反转角90°；T2扫描采用超级弛豫增强快速采集(Turbo-RARE)序列，采集11层大鼠头颅冠状位图像，扫描参数为，TR=2 500 ms，TE=33 ms，FOV=20 mm×20 mm，扫描层厚为0.5 mm，矩阵为256×256，反转角90°；BOLD-fMRI扫描参数，TR=160 ms，TE=33 ms，FOV=8.0 cm×6.4 cm，矩阵为192×128；DTI-MRI扫描参数，TR=5 000 ms，TE=27 ms，FOV=4.0 cm×4.0 cm，反转角90°，矩阵为128×128，扫描开始前，通过尾静脉注射造影剂0.1 mmol/Kg Gd-DTPA(德国)，后用300 μl盐水冲管；扫描结束后，原始数据传输至工作站处理，扫描数据通过MATLAB工作站进行分析；FA，FDi的测定是通过在瘤周区域及对侧相对应区域选取感兴趣区(region of interest，ROI)来完成；为了增加测量的准确性，每侧的ROI都选取相应区域内不同的5个点[13-14]，后计算rFA(相对FA=患侧瘤周FA/健侧对称FA)和rFDi(患侧瘤周FDi/健侧对称FDi)。

1.3皮质脊髓束损伤分级

（1）奉新县可以促进生态环境保护与资源开发利用相结合，重点发展山林经济，大力发展毛竹、苗木、油茶和猕猴桃四大林业基础产业。通过宣传、政策支持，调动社会积极性，吸引社会资金投入到四大产业，联合建设生产基地；培养或引进农业科技人才和国际化经营管理人才，大力推广种植技术，拓展市场；统一生产标准，合理规避绿色壁垒，创新名牌农产品，打造农业一体化示范园。同时依托现有的农产品资源，升级现有的奉新工业园区，引进资金，大力发展轻工业即农产品加工业，打造特色的奉新毛竹工艺品和猕猴桃深加工产品，利用交通、信息渠道扩散到周边区域，甚至辐射到周边省市，推动特色品牌产品走出去。

通过选取双种子点方法来示踪皮质脊髓束，利用BOLD-fMRI显示大鼠运动激活区域作为起始种子点，将大脑脚设置为示踪的终点，同时通过两个感兴趣的部分纤维束视为皮质脊髓束[15]。在本研究中，我们将14只大鼠脑胶质瘤模型中皮质脊髓束的损伤程度分为两级：(1)推挤：纤维束示踪成像提示受累皮质脊髓束位置改变，未见明显破坏、浸润，偶有纤维束表现为分散、压迫；(2)破坏：纤维束示踪成像表现为受累纤维束的部分断裂、破坏，FA图上表现为相应区域各项异性明显下降甚至无法测量出纤维束[10]。

1.4病理检测

磁共振扫描结束后，大鼠处死进行病理检查，所有大鼠均行心脏灌注，后快速离断颈部去处颅骨，取出脑组织；4%多聚甲醛固定24 h，病理切片选取与DTI肿瘤最大层面脑组织做前后连续切片；每个肿瘤标本进行常规HE染色及免疫染色Ki67染色[16]，以明确肿瘤细胞浸润程度以及肿瘤与白质纤维束的位置关系。

1.5统计学分析

采用GraphPad Prism Version 5.0软件，对肿瘤细胞实际浸润程度与rFA，rFDi的相关性进行分析，组间进行Student t test检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1瘤周浸润区域FA、FDi较健侧对称区域下降

瘤周区域及健侧相对应区域感兴趣区FA和FDi用来表示(图1)。瘤周区域平均FA(图1A)是0.6014，对侧区域平均FA是0.6964，差异有统计学意义(P<0.05)；瘤周区域平均FDi(图1B)是1.5761，对侧区域平均FDi是5.5299，差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果提示，脑胶质瘤瘤周区域的浸润性生长导致了患侧各向异性分数及纤维束密度下降。

注：图1A为大鼠脑胶质瘤瘤周区域FA<健侧对称区域，差异有统计学意义(P<0.05)，图1B为大鼠脑胶质瘤瘤周区域FDi<健侧对称区域，差异有统计学意义(P<0.05)；瘤周区域(peritumoral areas，PA)，健侧对称区域(contralateral，Con)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2rFA、rFDi下降与肿瘤细胞浸润相关

为进一步验证纤维束损伤是否与恶性肿瘤细胞对瘤周区域的浸润有关，本研究进行了rFA和rFDi与瘤周区域肿瘤细胞数、肿瘤细胞增殖指数的相关性分析，结果表明，瘤周区域肿瘤细胞数与rFA和rFDi负相关(r=-0.8581，r=-0.5077)(图2A)；瘤周区域恶性肿瘤细胞增殖数与rFA和rFDi负相关(r=-0.8411，r=-0.5755)(图2B)。以上结果提示，脑胶质瘤瘤周区域的恶性肿瘤细胞浸润程度可能导致患侧纤维束的破坏。

注：如图2A为瘤周区域恶性肿瘤细胞数与rFA及rFDi成负相关；如图2B为瘤周区域恶性肿瘤细胞数增殖指数与rFA及rFDi成负相关。肿瘤细胞比(tumor cells%)=瘤周区域肿瘤细胞/瘤周区域细胞总数，增殖指数(proliferation index%)=瘤周区域Ki67染色阳性细胞/瘤周区域恶性肿瘤细胞总数，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.3rFA和rFDi评估纤维束损伤程度

为进一步评估rFA和rFDi对纤维束损伤程度分级的意义，研究对不同受损级别纤维束损伤程度与rFA和rFDi进行了对比(图3)，并进行了不同纤维束损伤级别间病理检测(图4)。重度纤维束受损组rFA(0.7840)较轻度纤维束受损组rFA(0.9238)明显下降(图3A)，而rFDi在重度纤维束受损组(0.2494)较轻度受损组rFDi(0.2891)仅表现为下降趋势(图3B)，差异无统计学意义(P>0.05)。

注：图3A为重度纤维束受损组rFA较轻度纤维束受损组降低，差异有统计学意义(P<0.05)，图3B为重度纤维束受损组rFDi较轻度纤维束受损组降低，表现出降低的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。皮质脊髓束轻度受损(Grade_mild)，皮质脊髓束重度受损(Grade_severe)，n=14，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

图4A、B为恶性肿瘤区域10倍(A)和40倍(B)HE染色，可见肿瘤细胞核异形性高，核大且深染，图4C、D为瘤周区域10倍(C)和40倍(D)Ki67染色，可见瘤周区域恶性肿瘤细胞浸润性生长。

3 讨论

对于脑胶质瘤患者，病变对神经系统的破坏很多时候表现为对纤维传导束的侵袭或者推挤，所以纤维束损伤程度的分级能够为手术切除中有效保护神经功能提供有价值的信息[10，17]。本研究的目的就是通过量化的rFA和rFDi参数值来评估受胶质瘤影响的神经纤维束损伤程度。

DTI参数可用于评估不同级别胶质瘤瘤周水肿程度和恶性肿瘤细胞浸润程度[15，18]。本研究结果显示，瘤周区域和对侧对称区域的FA和FDi不同，表现为瘤周浸润区域FA和FDi下降，rFA和rFDi与瘤周区域肿瘤细胞和增殖指数负相关；病理染色与DTI参数结果显示，瘤周区域浸润的肿瘤细胞数目和增殖指数增加表明白质纤维束的损伤程度增加。由此推测，瘤周区域FA和FDi的下降很可能归因于肿瘤细胞的浸润和增殖。因此，研究结果证实脑胶质瘤恶性肿瘤细胞的浸润是导致白质纤维束损伤的重要原因。

DTI可以显示颅脑肿瘤患者的纤维束完整性以及受肿瘤影响的纤维束走形[7，19]。本研究证实瘤周区域rFA和rFDi在不同纤维束损伤分类中是不同的。在2013年本组的一篇临床报道[20]中证实，受肿瘤影响的白质纤维束分类能够作为判断肿瘤全切或者部分切除的一个指标。本研究结果显示，胶质瘤侵袭导致皮质脊髓束损伤程度与rFA和rFDi相关，提示DTI参数可以描述受肿瘤影响的纤维束不同损伤程度分类。因此，rFA和rFDi可以用来评估受肿瘤影响的瘤周区域皮质脊髓束的纤维走形，而对皮质脊髓束损伤分类的目的则是为显示肿瘤与正常脑组织之间的关系提供有价值的信息。

本研究中应用DTI参数与病理结果相结合来评估纤维束损伤程度，进一步研究拟应用其他不同的病理染色方法描述白质纤维束，以期更加准确、直观的反应肿瘤细胞侵袭对白质纤维束损伤的影响。

综上所述，在大鼠脑胶质瘤模型中，DTI参数可以量化评估纤维束损伤程度，并且量化参数评估可以为描述恶性肿瘤与受损纤维束之间的关系提供有价值的信息。