CD38 在人狼疮肾炎血中的表达及临床意义

崔道林，陈春丽

（曲靖医学高等专科学校基础医学院，云南曲靖 655000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种机制不详的自身免疫性疾病，其主要特征是存在致病性自身抗体、免疫失调和慢性炎症〔1〕。中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的浸润，可导致全身各组织和器官受损，以肾损伤为主。狼疮肾炎（lupus nephritis，LN）是一种肾小球肾炎，是SLE 常见且最严重的并发症之一，也是SLE 患者发病和死亡的主要原因。LN 与先天性免疫和固有免疫的过度激活密切相关，血液中除有丰富的中性粒细胞外，还有T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、单核细胞、浆细胞等免疫细胞，这些细胞与先天性免疫和固有免疫关系密切。因此，血液是寻找人LN 生物标志物的理想来源。

CD38 是一种多功能单链Ⅱ型的跨膜蛋白，该蛋白具有胞外酶和细胞受体功能。在淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK cell，简称“NK 细胞”）等免疫细胞中广泛表达〔2〕。CD38 可以催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD） 生成环二磷酸腺苷核糖（cyclic adenosine diphosphate ribose，cADPR），接着催化cADPR 生成二磷酸腺苷核糖（adenosine diphosphate ribose，ADPR）〔2〕。cADPR 作为信号传导介质，不但可以控制中性粒细胞、树突状细胞的定位和迁移运动〔3-4〕，而且是T 淋巴细胞活化和分化的调节剂〔5〕。CD38及其配体CD31 之间的相互作用，参与调节淋巴细胞与内皮细胞的黏附〔6〕。CD38 可以与多种免疫细胞形成横向交联，例如T 淋巴细胞的TCR/CD3 复合物，膜型免疫球蛋白，巨噬细胞的MHCⅡ类分子，B 淋巴细胞的CD19/CD81 复合物〔7-8〕。CD38 不仅可以识别T 淋巴细胞抗原受体（TCR）来调整抗原介导的T 淋巴细胞反应〔9〕，还可以识别B 淋巴细胞抗原受体（BCR）来增强B 淋巴细胞对抗原的敏感性〔10〕。由此可见，CD38 在T 淋巴细胞、巨噬细胞、B淋巴细胞等免疫细胞的生理和病理环境中均起着重要作用，推测CD38 可能与人LN 密切相关。

人LN 的早期准确诊断和迅速治疗对疾病进展至关重要。如果疾病症状能够得以缓解，10年存活率将从46% 提高至95%〔11〕。理想的生物标志物，不仅有助于疾病的早期准确诊断和迅速治疗，还有助于探寻特异性生物制剂的有效靶点。在本研究中，利用GEO（Gene Expression Omnibus）数据库，分析CD38 在人LN 血液中的表达及临床意义，预测CD38 参与人LN 的信号通路，旨在鉴定人LN 新的生物标志物。

1 材料和方法

1.1 数据来源 通过GEO 数据库下载基因芯片GSE72747， 输 入 类 型“Series”， 种属为“Homo sapiens”，研究类型为“Expression profiling by array”，数据注释平台为GPL570。免疫治疗前，LN 患者血样10 例（GSM1869396，GSM1869399，GSM1869402，GSM1869405，GSM1869408，GSM1869411，GSM1869414，GSM1869417，GSM1869420，GSM1869423）；免疫治疗后3 个月LN 患者血样10 例（GSM1869397，GSM1869400，GSM1869403，GSM1869406，GSM1869409，GSM1869412，GSM1869415，GSM1869418，GSM 1869421，GSM1869424）；免疫治疗后6 个月LN 患者血样10 例（GSM1869398，GSM1869401，GSM1869404，GSM1869407，GSM1869410，GSM1869413，GSM 1869416，GSM1869419，GSM1869422，GSM1869425）。

1.2 基因表达差异分析 从GEO 数据库下载GSE72747 芯片的“Series Matrix File（s）”和数据注释平台GPL570 的文件，将探针信息转变成基因名称，用基因表达矩阵提取CD38 表达数据。利用R语言引用“limma”数据包，分析LN 未治疗组和治疗组的表达差异并进行可视化。利用“strawberry－perl－5.32.0.1” 处理同一病人未治疗和已治疗的配对信息，运用R 语言生成配对差异图。

1.3 相关性分析 治疗时间分为未治疗、免疫抑制治疗3 个月和6 个月；患者性别分为男性和女性。文件整理成：第1 列为样品ID，第2 列为时间或性别，第3 列为CD38 基因表达量。采用Kruskal 检验分析CD38 与治疗时间的相关性，采用Wilcox 检验分析CD38 与患者性别的相关性。运用R 语言将差异进行可视化。

1.4 统计学分析 利用SPSS 23.0 软件对临床数据进行Pearson 相关分析，筛选与CD38 相关性显著的临床数据。临床数据包括：SLEDAI 评分、ds DNA 抗体、肾小球滤过率等。对相关性显著的临床数据进行多元线性回归分析，自变量包括ds DNA 抗体、肾小球滤过率和CD38；因变量为SLEDAI 评分（连续数值型变量）。

1.5 CD38 基因GSEA 富集分析 采用GSEA 4.1.0软件对CD38 进行富集分析，根据GSE72747 中CD38 表达的平均值将CD38 表达分为高表达组和低表达组。关键参数设置：置换次数为1000；基因集数据库为c2.cp.kegg.v7.2.symbols.gmt［Curated］；P < 0.05 为显著富集基因集。

2 结果

2.1 CD38 在LN 患者血液中表达差异分析 LN 患者经过免疫治疗后，血液中CD38 的表达量显著降低（P< 0.05）；免疫治疗前后配对分析显示，相对于免疫治疗前，免疫治疗后血液中CD38 的表达量出现显著性下调（P< 0.05）。见图1。

图1 CD38 在LN 患者血液中表达差异分析

2.2 CD38 与治疗时间和患者性别的相关性分析随着免疫治疗时间的延长，LN 患者血液中CD38 的表达量显著下调（P< 0.05）；不同性别的LN 患者，血液中CD38 的表达量无显著性差异（P= 0.554）。见图2。

图2 CD38 与治疗时间和患者性别的相关性分析

2.3 临床病理特征的Pearson 相关性分析 CD38的表达量与ds DNA 抗体和SLEDAI 评分相关性显著（P< 0.05），CD38 的表达量与肾小球滤过率弱相关（相关系数r > 0.3）。见表1。

表1 临床病理特征的Pearson 相关性分析（n=30）

2.4 临床病理特征的多元线性回归分析 该模型通过F 检验，差异具有统计学意义（P < 0.05）。D－W值为1.596，接近2，表明该模型不存在自相关性。方差膨胀系数（variance inflation factor，VIF）小于5，说明自变量之间不存在多重共线性。CD38 与SLEDAI评分呈正相关（P < 0.05），ds DNA 抗体与SLEDAI评分相关性不显著（P = 0.74），肾小球滤过率与SLEDAI 评分相关性不显著（P = 0.322）。见表2。

表2 临床病理特征的多元线性回归分析

2.5 CD38 基因GSEA 富集分析 对LN 患者免疫治疗后CD38 表达量下调的可能机制进行初步分析。CD38 低表达样本主要富集在丝裂原激活蛋白激酶（mitogen activation protein kinase，MAPK）信号通路、Wnt 信号通路、JAK－STAT 信号通路、脂肪细胞因子信号通路、多糖生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢。见表3。

表3 CD38 基因GSEA 信号通路富集分析结果

3 讨论

本研究分析了CD38 在LN 患者血液中的表达差异，结果显示LN 患者免疫治疗后，血液中CD38的表达量呈现显著性下调，提示CD38 的表达量与人LN 密切相关，CD38 参与了人LN 的发病机制。一般认为人LN 的发生与免疫复合物（immune complex，IC）有关，因为几乎所有SLE 患者肾脏都发现了IC 沉积物〔12〕。然而，沉积IC 不足以驱动人LN 的发展，还涉及其他病理因素〔13〕。LN 患者肾脏的组织病理学数据表明，肾脏内发生的炎症是免疫失调的缩影，实质细胞和白细胞之间的相互作用决定了肾脏损害的程度〔14〕。中性粒细胞胞外陷阱在先天免疫反应中起关键作用，并且它们还调节适应性免疫反应〔15〕。巨噬细胞、B 淋巴细胞、树突状细胞、T 淋巴细胞、中性粒细胞浸润肾组织，可导致肾脏的损失〔14〕。CD38 对中性粒细胞和树突状细胞的迁移很重要〔3-4，16〕。B 淋巴细胞是人LN 有希望的治疗靶标，因为它们是发病机制的关键〔17〕。B 淋巴细胞的致病作用不仅限于自身抗体的产生，还扩展到抗原呈递，T 淋巴细胞活化，树突状细胞成熟的调节以及细胞因子的分泌。随着B 淋巴细胞的发育成熟，CD38 的表达量逐渐增加。CD38 刺激B 淋巴细胞的成熟需要磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）、布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton′s tyrosine kinase，BTK）、Src 家族激酶（Src family kinase，SFK）和胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）的参与〔18〕。CD38 依赖PI3K、BTK 和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）激活核因子κb（nuclear factor kappalight-chain-enhancer of activated B cell，NF-κB）〔19〕，从而促进B 淋巴细胞向浆细胞分化，浆细胞能分泌形成IC 的自身抗体。以上证据表明，CD38 促进SLE 转化为LN 或加重其症状。

随着治疗时间的增加，血液中CD38 的表达量逐渐降低，与LN 患者症状减轻一致。因此，CD38 的表达量可衡量人LN 免疫治疗的效果。研究表明，ds DNA 抗体除了形成IC 外，还可以上调肾细胞中与炎症和纤维化有关的基因，导致肾脏的炎症和纤维化，从而促进人LN 的发病或加重其临床症状〔20-21〕。SLEDAI 评分是经验丰富的临床医师对狼疮疾病活动进行评估的有效模型，代表了狼疮研究领域专家组的共识〔22〕。表2 结果显示CD38 的表达量显著影响SLEDAI 评分。因此，CD38 可作为LN 患者早期诊断或症状轻重的生物标志物。

免疫系统自我耐受性丧失，自身反应性T 淋巴细胞和B 淋巴细胞被异常激活，大量促炎细胞因子的产生，这些细胞因子对组织损伤和局部炎症起引发或放大作用〔23〕。研究表明，MARK 信号通路、Wnt信号通路和JAK-STAT 信号通路参与人LN 发病的分子机制〔24〕。表3 结果表明，CD38 可调节MARK信号通路、Wnt 信号通路和JAK-STAT 信号通路，抑制促炎细胞因子的生成，从而特异性地预防肾损失。

综上所述，本研究运用生物信息学方法分析LN 患者免疫治疗前后血液中CD38 表达量的差异。Pearson 相关性分析和多元线性回归分析表明CD38可作为人LN 早期诊断或治疗的生物标志物。GSEA富集分析结果显示CD38 通过MARK 信号通路、Wnt 信号通路和JAK-STAT 信号通路参与人LN 的发病机制。