碱提砂仁多糖的结构表征及其抗氧化活性研究

韦 志，阮心眉，戴涛涛，付 敏，袁建成，李 俶, ，陈 军

（1.南昌大学, 食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047；2.广西壮族自治区农业科学院, 广西果蔬贮藏与加工新技术重点实验室，广西南宁530007）

砂仁（Amomum villosum，A.villosum）是姜科（Zingiberaceae）豆蔻属的植物果实，与益智仁、槟榔、巴戟天并称为我国“四大南药”，同时也是《中华人民共和国药典》（2015年版）收录的重要品种[1]。砂仁味道丰富，有酸甜苦辣咸味，砂仁的花、果、根、茎、叶部位均可入药。它具有“化湿开胃、理气止痛、温脾止泻、行气安胎”等功效[2]。研究结果表明砂仁中的挥发油成分具有显著的抗溃疡、促进肠胃蠕动、胃排空和镇痛等作用[3]。砂仁中含有较高含量的多酚、多糖等多种生物活性成分，具有明显的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、镇痛等作用[4-6]。

多糖一般是指由十种或更多单糖通过糖苷键链接而成的聚合物。植物多糖是一种天然大分子，在其生命活动中发挥重要作用[7]。近年来，多糖因无毒、可生物降解、生物相容性好，而且与合成聚合物相比价格更低等优点备受关注。所有这些优点赋予了多糖及其衍生物在不同领域的广泛应用，如食品、生物医学等领域[8]。

目前，溶剂法提取多糖主要包括热水浸提、酸浸提、碱浸提、螯合剂浸提（草酸铵、EDTA等），不同溶剂提取的多糖具有不同的结构及生物活性[9]，这可能是因为植物中多糖往往与其他成分结合共存，以及多糖在不同溶剂条件下的存在形式不同导致（如构象等）。热水浸提法只能提取一些水溶性的长链多糖分子，酸法是工业上提取果胶的常用技术，碱法则是通过释放与多酚或其它小分子结合的多糖，螯合剂的作用机理则是与钙离子结合降低多糖大分子之间的交联。有文献报道，碱法提取的多糖在抗氧化性上优于传统的水提多糖[10]。

为了获得更好的生物活性的多糖，本实验采用碱浸提法提取砂仁多糖，探究碱性提取条件下砂仁多糖的结构特性和抗氧化性，旨在为砂仁多糖的应用提供理论依据，对砂仁资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

海南砂仁 湛江中国热带农业科学院农产品加工研究所；咔唑、单糖组成标准品、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮（PMP）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、葡聚糖标准品、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、半乳糖醛酸 美国Sigma公司；考马斯亮蓝G-250 北京索莱宝科技有限公司；牛血清白蛋白 阿拉丁试剂（上海）有限公司；葡萄糖标准品 西陇科学股份有限公司；所有试剂 均为分析纯。

TGL-20B高速离心机 上海安亭科学仪器厂；HR-10中药粉碎机 浙江哈瑞工贸有限公司；RE-2000A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；AlpHa1-2LD冷冻干燥机 德国Christ公司；TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Agilent 1260高效液相色谱仪（配Brookhaven BIDNDC示差检测器）、Agilent 1260型液相色谱仪（配DAD检测器） 美国Agilent公司；Nicolet 5700傅里叶红外光谱仪 美国热电公司；TGA 4000热重分析仪 美国PE公司；JSM-6701F冷场发射扫描电镜 日本电子株式会社；D8 Advance X射线衍射仪德国Bruker公司；Gen 5通用型酶标仪 美国Bio Tek公司。

1.2 实验方法

1.2.1 砂仁多糖样品制备 根据Gao等[11]方法稍作修改提取砂仁多糖。采用中药粉碎机将干燥后（含水量小于5%）砂仁粉碎，过60目标准筛。80%乙醇浸泡砂仁粉末过夜，除去脂溶性杂质。挥发蒸干乙醇后，加入3000 mL的0.1 mol/L NaOH（含0.01 mol/L NaBH4），在室温条件下提取多糖2 h。粗提液经离心（4800 r/min，15 min）得上清液，然后经旋转蒸发仪在60 °C条件下，浓缩上清液至原上清液的1/4后，加入95%乙醇使溶液乙醇浓度达到80%。样品经醇沉过夜后离心取沉淀，加水复溶。以Sevag法去除蛋白，即氯仿-正丁醇（4:1，v/v）溶液与砂仁多糖水溶液振摇混合（1:4，v/v），重复四次，使蛋白质变性析出，离心去除变性蛋白。蒸馏水透析（8～14 kDa）3 d。然后旋蒸，浓缩，经真空冷冻干燥获得砂仁多糖。

1.2.2 砂仁多糖的化学组成测定

1.2.2.1 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法[12]测定砂仁多糖的总糖含量。取1.0 mL不同浓度的葡萄糖标准品溶液或0.1 mg/mL的多糖溶液或蒸馏水（空白），与1.0 mL的5%的苯酚溶液混合均匀，加入4.0 mL浓硫酸摇匀混合，静置30 min，于490 nm处测定吸光度值。以葡萄糖标准品溶液的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线计算砂仁多糖的总糖含量（μg/mL）。

1.2.2.2 糖醛酸含量测定 采用硫酸-咔唑法[13]测定多糖中的糖醛酸含量。取1.0 mL的不同浓度的半乳糖醛酸溶液或1 mg/mL的多糖溶液或蒸馏水（空白），在冰水浴条件下加入6.0 mL浓硫酸混合均匀，放入85 ℃水浴中恒温保持20 min，取出冷却至室温后，分别向各管中加入0.2 mL的0.1%咔唑-乙醇溶液，在室温下放置2 h，于530 nm处测定吸光度值。以半乳糖醛酸溶液的浓度（μg/mL）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。以标准曲线计算砂仁多糖的糖醛酸含量（μg/mL）。

1.2.2.3 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法[14]测定蛋白质含量。取1.0 mL的不同浓度的牛血清白蛋白溶液或0.1 mg/mL的多糖溶液或蒸馏水（空白）加入5.0 mL的考马斯亮蓝溶液混匀，静置5 min。于595 nm处测定吸光度值。以牛血清白蛋白的溶液浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制牛血清白蛋白标准曲线。以标准曲线计算砂仁多糖的蛋白质含量（μg/mL）。

1.2.3 多糖的单糖组成测定 参考Hu等[15]的方法，称取2.0 mg冻干的多糖样品，加入2 mol/L三氟乙酸溶液0.5 mL，在120 °C条件下水解120 min后用氮吹仪吹干。向干燥后的样品中加入溶于无水甲醇的0.5 mol/L的PMP试剂和0.3 mol/L的NaOH溶液各0.5 mL，充分混匀后置于70 °C水浴反应30 min。冷却至室温后，加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl，混和均匀。加入1.0 mL氯仿，充分振荡萃取，4800 r/min离心15 min，去除氯仿层，共萃取三次。合并滤液，取水相层，过0.22 μm滤膜后，采用高效液相色谱检测。单糖标准品无需水解步骤，其他步骤同样品处理。检测配置与条件：Agilent 1260型液相色谱仪（配DAD 检测器）、Thermo ODS-2 C18柱（4.6×250 mm，5 μm）。流动相为磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，pH7.0）与乙腈的混合液（体积比82:18），流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL，检测波长245 nm。

1.2.4 多糖的相对分子量测定 采用高效尺寸排阻色谱法对得到的多糖进行分子量测定[16]。采用Agilent 1260型液相色谱仪（配 Brookhaven BIDNDC示差检测器），Agilent PL aquagel-OH系列凝胶过滤色谱柱（7.5×300 mm，8 μm）。流动相为超纯水（含 0.02% NaN3），流速为 0.5 mL/min，柱温 30 °C，进样量100 μL。配制1.0 mg/mL多糖溶液或1.0 mg/mL不同分子量（Mw：5、25、50、150、410、670 kDa）的葡聚糖标准品溶液，过0.45 μm水相滤膜后，进样检测。以葡聚糖分子量标准品的对数值（lgMw）为纵坐标，保留时间（min）为横坐标，绘制曲线。以标准曲线计算砂仁多糖的相对分子量（kDa）。

1.2.5 红外光谱分析（FTIR） 采用傅里叶变换红外光谱对多糖的分子结构进行分析[17]。取样品约1.0 mg，置于干燥的玛瑙研钵中，在红外灯照射下加入KBr约140 mg，研磨均匀后压片。用傅立叶红外光谱仪在400～4000 cm-1区内进行扫描，初步分析多糖的官能团。

1.2.6 扫描电镜（SEM）多糖的扫描电镜分析 取少量的干燥砂仁多糖样品粘着于样品台上，镀导电金，采用冷场发射扫描电镜在250倍和2000倍下进行观察[18]。

1.2.7 热重分析（TGA）多糖的热重分析 采用热重分析仪对砂仁多糖的热特性进行研究[19]，样品称取5.0 mg，测试温度范围 30～600 °C，以 10 °C/min 的速率升温，在固定速率通氮气环境下测定多糖的受热质量变化情况。

1.2.8 X衍射分析（XRD） 采用X衍射仪对多糖的晶体结构进行分析[20]。测定范围为 5°～50°（2θ），步长 0.02°，计数时间 1 s/步。

1.2.9 多糖的抗氧化性指标测定

1.2.9.1 DPPH自由基清除能力 参考Gomez-Mejia等[21]方法，将1.0 mL不同浓度多糖溶液（0～2 mg/mL）或抗坏血酸溶液（阳性对照）或乙醇溶液（空白）与1.0 mL 0.2 mmol DPPH（50%乙醇溶解）摇匀，避光孵育30 min后于517 nm处测量吸光值，实验均平行测定3次，以DPPH自由基清除率表示DPPH自由基清除能力，计算公式如下：

式中：中Ao为空白吸光度；Ai为样品或阳性对照吸光度。

1.2.9.2 ABTS+自由基清除能力 参考Deseo等[22]的方法，将 5.0 mL ABTS储备溶液（7 mmol/L）与5.0 mL K2S2O7溶液（2.45 mmol/L）混合后避光置于4 °C冰箱内反应12～16 h制备得ABTS溶液。反应前将ABTS溶液用磷酸缓冲液（0.1 mol/L，pH7.4）稀释至 734 nm处吸光度为 0.7±0.02，即 ABTS工作液。取40 μL多糖溶液或抗坏血酸溶液（阳性对照）或乙醇溶液（空白）于96孔板中，加入970 μL ABTS工作液混匀，避光反应6 min后用酶标仪测定734 nm下吸光度，以ABTS+自由基清除率表示ABTS+自由基清除能力，计算公式如下：

式中：中Ao为空白吸光度；Ai为样品或阳性对照吸光度。

1.2.9.3 羟基自由基清除能力 参考Wang等[23]的方法，取1.0 mL不同浓度的多糖溶液或抗坏血酸溶液（阳性对照）或乙醇溶液（空白）置于10 mL试管中，加入1.0 mL FeSO4溶液和1.0 mL水杨酸-乙醇溶液，混匀，加入1.0 mL H2O2溶液，充分混匀，放入37 °C水浴 30 min后，立即在510 nm处测定吸光值，平行三次，以羟基自由基清除率为表示羟基自由基清除能力，计算公式如下：

式中：中Ao为空白吸光度；A1为样品或阳性对照吸光度；A2为样品不加H2O2溶液的吸光度。

1.3 数据处理

本实验数据均重复测定三次。采用Excel2019和SPSS25.0统计分析软件对实验数据进行处理，结果表示为平均值±标准偏差。使用Origin 2020软件对实验数据进行作图。

2 结果与分析

2.1 砂仁多糖的得率与化学组成分析

本实验在碱性条件下，提取砂仁多糖，经脱蛋白处理后，测定其总糖含量、糖醛酸含量和蛋白质含量，标准曲线如图1。测定结果表明砂仁多糖的提取得率为3.97%±0.31%，总糖含量为 37.10%±1.43%，糖醛酸含量达到65.66%±2.02%，说明砂仁多糖是一种酸性多糖；蛋白质的含量为4.36%±0.71%，表明残留的蛋白可能是蛋白质溶于碱性溶液中，并与单糖结合，形成难以去除的蛋白质[24]。

图1 砂仁多糖的化学组成含量测定的标准曲线Fig.1 Standard curve for determination of chemical composition of A.villosum polysaccharide

2.2 单糖组成分析

如图2液相色谱分析表明，砂仁多糖是一种杂多糖，含甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖。其相对摩尔百分比分别为 0.74%、0.71%、8.13%、13.41%、5.31%、14.84%、18.84%、38.02%。其中阿拉伯糖、木糖、半乳糖和半乳糖醛酸构成砂仁多糖的主要单糖成分。该结果与樊亚鸣等[25]研究的春砂仁多糖组成结果相似，均含有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其他组分的不同可能是因为砂仁的产地和品种的不同。

图2 砂仁多糖的单糖组成与单糖标准品Fig.2 GC chromatogram of the monosaccharide standards and monosaccharide composition of A.villosum

2.3 多糖相对分子量

如图3所示，依据多糖分子量大小Mw的对数值与保留时间成线性关系，绘制不同分子量的葡聚糖标准品的标准曲线：lgMw=-0.6746t+14.35（其中t表示保留时间），R2=0.9985。依据响应值最大时的保留时间，由标准曲线计算出砂仁多糖的相对分子量为95.46 kDa。

图3 砂仁多糖的相对分子量图Fig.3 Relative molecular weight curves of A.villosum polysaccharide

2.4 红外光谱分析

根据红外光谱吸收峰的位置和强度可判断多糖的基础官能团。一般来说，多糖的主要特征吸收峰位于 3100～3700 cm-1和 2800～3000 cm-1，前者被认为是分子间氢键和分子内氢键引起的O-H伸缩振动，后者归因于游离碳水化合物的C-H不对称伸缩振动[15]。如图4所示，在1615～1653 cm-1附近的强吸收峰，表明存在羰基的C=O不对称伸缩振动[23]，而在1411～1423 cm-1附近的弱吸收峰则反映了羰基的C-O伸缩振动，表明多糖中含有糖醛酸[12]，与砂仁多糖的化学组成结果一致。1075～1100 cm-1处的吸收峰，表明主链中存在吡喃糖环[26]。红外光谱表明砂仁多糖具备碳水化合物典型吸收峰，且存在吡喃糖环结构。

图4 砂仁多糖的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of A.villosum polysaccharide

2.5 扫描电镜

SEM图像提供了砂仁多糖的表面形貌特征。SEM结果表明（图5），砂仁多糖的表观形貌为片状结构。放大250倍可以看到，多糖形状不规则，大多为片状结构，有少量块状存在，碎片形状并不均一。该结果与Zhou等[27]研究结果一致，其观察到从阳春砂仁中提取的酸性多糖在SEM中呈现片状的疏松结构。放大2000倍下观察可见多糖表面粗糙，边缘不规则，这可能是冻干时冰升华。Zhu等[28]研究也发现，在高倍放大倍数下，多糖表面呈现不均匀的鳞片结构和少量的凹陷。

图5 砂仁多糖的扫描电镜图Fig.5 SEM images of A.villosum polysaccharide

2.6 热重分析

由图6热重分析曲线可以看出，砂仁多糖在高温过程中三次主要失重，可大概划分为40～150 °C、151～400 °C、401～600 °C 三个阶段。第一阶段可能为结晶水的散失[29]，失重率约为4.21%；第二阶段可能为碳水化合物长链的降解和碎片的解聚，失重率约为30.55%[30]，第三阶段质量损失减缓，可能是多糖的在进一步分解，剩下的多糖的热稳定性较好或者多数多糖已经碳化，从而导致失重缓慢[31]。在600 °C时剩余质量百分比为20.06%。不同来源的植物多糖往往具有相似的热重分析曲线，但其热降解温度和质量损失率可能存在差异。张华峰等[31]研究发现，当温度从248 °C升至350 °C时，滇黄精多糖的失重率约为58.59%，并将该现象其归因于多糖分子剧烈的解聚和分解作用。王占一等[32]研究发现石榴皮多糖在温度 225.4～327.9 °C内质量损失率为 46.5%，而以石榴皮多糖与亚硒酸钠为原料制备石榴皮多糖硒酸酯，其在600 °C前已经基本分解完全。由此可知，砂仁多糖具有较好的热稳定性。

图6 砂仁多糖的热重分析曲线Fig.6 TGA of A.villosum polysaccharide

2.7 X衍射分析

采用X衍射对砂仁多糖的晶体结构进行分析。一般来说，衍射峰的尖窄可以反映晶体结构，衍射宽峰反映的是非晶结构，非晶区域的分子间键弱于晶体区域的分子间键[33]。如图7所示，XRD结果表明砂仁多糖在15°～30°之间，有一个峰宽较宽、强度较大的峰。因此，砂仁多糖的结晶度较低，属于低结晶度材料[34]。此外，半结晶区在20.75°。该结果与Zhu等[28]研究水提醇沉法提取海南砂仁多糖的X衍射的分析结果一致，均是半结晶结构。

图7 砂仁多糖的X-衍射图Fig.7 XRD of A.villosum polysaccharide

2.8 砂仁多糖的体外抗氧化活性

2.8.1 DPPH自由基清除能力的测定 如图8a所示，砂仁多糖的DPPH自由基清除率在0～2.0 mg/mL范围内，表现出浓度依赖性，即随着多糖浓度的升高，其DPPH自由基清除率逐渐升高。在浓度为2.0 mg/mL时，砂仁多糖的自由基清除能力接近抗坏血酸，自由基清除率达到96.13%。而Zhang等[35]研究发现砂仁粗多糖在5.0 mg/mL浓度下，DPPH自由基清除能力为73.5%。本研究的砂仁多糖对DPPH自由基半数抑制对应的浓度（IC50）为0.81 mg/mL，显示出较好的抗氧化性。

2.8.2 ABTS+自由基清除能力的测定 如图8b所示，砂仁多糖的ABTS+自由基清除率在在0～2.0 mg/mL范围内，表现出浓度依赖性，即随着多糖浓度的升高，其ABTS+自由基清除率逐渐升高。砂仁多糖对ABTS+自由基半数抑制对应的浓度（IC50）为0.65 mg/mL。抗坏血酸在0.25 mg/mL时，达到最大抑制能力，但是在1.0 mg/mL时，砂仁多糖的自由基清除率达到了80.95%，清除率较高。相比于其他多糖，如仙人掌皮多糖[36]（在10mg/mL时，对ABTS+自由基清除率为39.85%），砂仁多糖具有更强的ABTS+自由基清除能力。

图8 砂仁多糖的体外抗氧化性Fig.8 In vitro antioxidant activities of A.villosum polysaccharide

2.8.3 羟基自由基清除能力的测定 如图8c所示，随着砂仁多糖浓度的增加，其羟基自由基的清除率增大。在0.5 mg/mL时，抗坏血酸的羟基自由基清除率达到97.65%。同时，砂仁多糖的羟基自由基清除率随着浓度的增大而增大，在2.0 mg/mL时，砂仁多糖的羟基自由基清除率达到67.22%，对羟基自由基半数抑制对应的浓度（IC50）为1.20 mg/mL。Zhang等[35]研究发现在5.0 mg/mL浓度下，阳春砂仁粗多糖的羟基自由基清除能力为66.3%，两者的羟基自由基清除能力相近。综上，砂仁多糖具有较好的抗氧化能力。

3 结论

本研究选用海南砂仁为原料，采用碱液浸提法提取多糖，对所得砂仁多糖进行理化性质、表观形貌、晶型和热重分析，并评价其体外抗氧化活性，以期为砂仁多糖发展奠定良好基础。主要结论如下：砂仁多糖的提取得率为3.97%，总糖含量为37.10%，糖醛酸含量为65.66%，蛋白质的残留含量为4.36%。砂仁多糖的主要单糖组成为阿拉伯糖、木糖、半乳糖和半乳糖醛酸，其摩尔百分比分别为38.02%、18.84%、14.84%和13.41%，且分子量为95.46 kDa；砂仁多糖是一种低结晶度、具有吡喃环、热稳定较好的片状酸性杂多糖，具备多糖普遍的表观形貌特征；砂仁多糖的三种体外抗氧化模型研究表明，砂仁多糖对DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的半数抑制对应的浓度（IC50）分别为 0.81、0.65和 1.20 mg/mL，具有较好的抗氧化能力。该研究证实砂仁多糖的抗氧化能力强，可作为天然抗氧化剂，值得更深入的研究其抗氧化机制，该研究结果可为砂仁多糖的开发和利用提供理论应用基础。