基于光谱学技术结合分子模拟研究芹菜素与大豆分离蛋白的相互作用

鄢雨中，陈 蕾，张国文

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

大豆(Soybean)是一种具有很高食用价值和经济价值的农作物，在食品中非常常见。大豆也是蛋白质含量很高的农作物，含有约为40%的蛋白质，其中的大豆分离蛋白(Soybean protein isolate,SPI)不仅包含了人体所需要的8种氨基酸，而且其含量也能满足人体所需要。大豆分离蛋白具有营养丰富、绿色健康等优点，可以有效补充人体所需的蛋白，且消化率可高达93%～97%。在健康方面可帮助人体制造对抗病毒的抗体，补充免疫细胞，增强免疫力，还可以降低胆固醇、血糖，促进钙元素吸收[1]。

芹菜素(Apigenin，API)是一种黄酮类化合物，常被称为芹黄素和洋芹素[2]，在西芹、水芹、橙子和洋甘菊等绿色蔬菜、新鲜水果及菊科植物中含量丰富，具有抗肿瘤、抗炎、降压和舒张血管等药理活性[3]，是一种治疗效果优良、安全低毒的植物活性成分，已被广泛应用于食品和医药领域中。

近年来黄酮类化合物与蛋白质相互作用的研究受到了普遍关注。江名等[4]采用荧光光谱法结合分子模拟技术研究了API与人血清蛋白的相互作用，发现芹菜素能猝灭人血清蛋白内源性荧光，API的结合位点位于ⅡA亚域处，分子模拟显示二者主要通过疏水作用结合。刘勤勤[5]利用荧光光谱茶多酚与大豆分离蛋白之间的相互作用，结果表明，茶多酚对大豆分离蛋白有较强的荧光猝灭作用且为静态猝灭，二者反应的作用力主要是范德华力和氢键作用，同步荧光光谱显示茶多酚与大豆分离蛋白中色氨酸残基发生相互作用，使其周围的疏水作用减少。本文研究黄酮类化合物API与SPI的结合性质、结合模式以及对SPI结构的影响，旨在为API-SPI包载体系的构建以及SPI功能性质的改善提供理论基础。

图1 芹菜素的分子结构

1 实验部分

1.1 实验仪器

TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；F-7000型荧光光度计(日本日立公司)；MOS-450圆二色谱仪(法国Bio-Logic公司)；Varioskan LUX型酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；pHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；5430R型高速台式离心机(德国艾本德股份公司)。

1.2 实验试剂

大豆分离蛋白(上海源叶生物科技公司，纯度≥99.5%)；芹菜素(陕西慧科植物开发有限公司，纯度98%)；8-苯氨基-1-萘磺酸(ANS)；pH 7.07的PBS缓冲溶液(以Na2HPO4·12H2O与NaH2PO4·2H2O配制而成)；十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O，西陇化工股份有限公司，纯度≥99.0%)；磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O，上海精析化工科技有限公司纯度，≥99.0%)；其他试剂的纯度均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 荧光猝灭光谱的测定

移取3.0 mL质量浓度为3 mg·mL-1的SPI溶液于比色皿中，在280 nm的激发波长下扫描其荧光光谱后，再向装有SPI溶液的比色皿中依次加入API(3.7×10-3mol·L-1，3 μL/次，共10次)，每次加入API后将溶液混合均匀，去除气泡后静置2 min，再扫描其290～500 nm的荧光光谱，共测得11条光谱曲线。按照上述操作，分别测定25，31和37 ℃ 3个温度下的荧光光谱，并记录数据，所有的荧光数据都需经过以下公式进行校正以扣除“内滤光效应”所带来的实验误差[6]：

Fc=Fme(A1+A2)/2

(1)

式中Fc为校正后的荧光强度值；Fm为实验所测得的荧光强度值；A1为API在激发波长下的紫外吸光度值；A2为API在发射波长下的紫外吸光度值。

1.3.2 同步荧光光谱的测定

移取3.0 mL质量浓度为3.0 mg·mL-1的SPI溶液于荧光池中，逐次滴加3 μL的API溶液10次，在25℃下，设置激发和发射狭缝宽均为2.5 nm，扫描290～420 nm波长范围内发射和激发波长间隔Δλ分别为15和60 nm的同步荧光光谱，各得到11条光谱曲线。

1.3.3 三维荧光光谱的测定

移取3.0 mL质量浓度为3.0 mg·mL-1的SPI溶液于荧光池中，在200～600 nm的激发和发射波长下，记录游离的SPI溶液和加入了15 μL 3.7×10-3mol·L-1API的SPI-API复合物溶液的三维荧光光谱。

1.3.4 紫外-可见吸收光谱的测定

移取3.0 mL质量浓度为3.0 mg·mL-1的SPI溶液于比色皿中，紫外光谱扫描之后，依次加入3.7×10-3mol·L-1的API(5 μL/次)，混合均匀并静置2 min，然后测定220～320 nm范围的吸收光谱，并扫描对应游离浓度的API的吸收光谱。

1.3.5 蛋白质表面疏水性测定

采用ANS荧光探针法测定蛋白质疏水性。先将SPI溶液溶于PBS溶液中，取SPI溶液2 mL，加入20 μL 8.0 mmol·mL-1ANS，混合均匀后，静置3 min。设置激发波长λex=390 nm，发射波长λem=470 nm，二者狭缝均设为5 nm，测定荧光强度后，依次加入3.7×10-3mol·L-1的API(5 μL/次，共4次)，混合均匀并静置2 min，测定荧光强度，每组测定3次，取平均值。重复以上操作，分别测量在SPI溶液质量浓度为0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg·mL-1时的荧光强度，将计算后所得的平均荧光强度作为因变量，SPI溶液的质量浓度作为自变量，绘制线性回归曲线，所得的相应曲线斜率即为蛋白质表面疏水指数S0，再以曲线的斜率对API浓度作图，即可获得蛋白质表面疏水性的变化。

1.3.6 蛋白质游离巯基含量测定

采用Dong等[7-8]的方法测定蛋白质游离巯基含量。配制尿素-Tris-Gly缓冲液(0.086 mol·L-1Tris，0.09 mol·L-1Gly，4 mmol·L-1EDTA，pH 8.0，8 mol·L-1尿素)，然后配制Ellman试剂(4 mg DTNB溶解于1 mL的Tris-Gly缓冲液)，先取11个小管，分别加入1 mL 3.0 mg·mL-1的SPI溶液，按照梯度分别加入2 μL 3.7×10-3mol·L-1API，混合均匀。再取11个小管分别加入1 mL尿素-Tris-Gly缓冲液，10 μL Ellman试剂，250 μL不同浓度的API-SPI混合液，用PBS缓冲溶液作空白，在412 nm处测定吸光度，巯基含量的计算公式如下。

巯基含量/(μmol·g-1)=73.53×A412/ρ

(2)

其中A412为412 nm处吸光值；73.53=106/(1.36×104)，1.36×104为摩尔消光系数(L·cm·mol-1)；ρ为蛋白质量浓度(mg·mL-1)。

1.3.7 圆二色光谱的测定

分别移取2 mL质量浓度为3.0 mg·mL-1的SPI溶液，0，6，48 μL浓度为3.7×10-3mol·L-1的API溶液，配制[API]:[SPI]摩尔比率为0:1，2:1，16:1的样品，在190～250 nm范围内扫描样品的圆二色光谱，每组扫描3次，通过在线Dichroweb网站求出加入不同浓度的API后SPI的二级结构含量(α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲含量)，分析API对SPI二级结构的影响。

1.3.8 分子模拟

采用Discovery studio软件对SPI-API复合物进行分子建模。SPI中含有的蛋白类型主要为7s型与11s型。两种类型蛋白的晶体结构从Protein Data Bank网站下载(1h9z)，去除水分子再进行加氢及加电荷处理。从PubChem数据库中获得API的3D结构。利用分子模拟中的CDOCKER程序分别进行API与两种蛋白的对接模拟，获得API与SPI结合的最佳模式以及周围氨基酸残基的相互作用情况。

2 实验结果

2.1 荧光猝灭机理

图2为向SPI中不断滴加API后SPI的荧光光谱。随着滴加的API浓度的不断升高，SPI在347 nm处的荧光强度逐渐降低，表明API与SPI相互作用导致了SPI的荧光猝灭。

λ/nm

温度是影响荧光猝灭的一个关键因素，可利用不同温度下的荧光数据通过计算得出猝灭常数来判断猝灭类型[9]。荧光猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭[10]，动态猝灭是指激发态荧光分子与猝灭剂发生能量转移或物理碰撞使其荧光猝灭；静态猝灭是指荧光分子与猝灭剂相互结合形成一种复合物，该复合物使荧光分子荧光强度降低，从而产生了荧光猝灭现象[11]。一般而言，当猝灭常数值随温度的上升而减小时，将其判定为静态猝灭，反之则为动态猝灭[12]。本实验测定了25，31和37 ℃ 3个温度下API对SPI的荧光猝灭数据，运用Stern-Volmer方程进行计算[13]。

F0/F=1+KSVc=1+Kqτ[API]

(3)

式中:F0和F分别代表API加入前后SPI的荧光强度；Kq为猝灭速率常数；Ksv为猝灭常数；τ0为不含有猝灭物质时荧光分子的平均寿命，为10-8s[14]。

通过F0/F对[API]作线性回归方程可得出Ksv值，结果如图3与表1所示，Ksv值随温度的上升稍有增大，但是Kq的值远高于最大扩散碰撞常数(2.0×1010L·mol-1·s-1)，超过了扩散控制的极限，所以推断API对SPI的荧光猝灭是一个静态猝灭过程[15]。

AP/(10-6 mol·L-1)图3 在25、31和37 ℃三个温度条件下的Stern-Volmer曲线

表1 不同温度下API与SPI作用的结合参数

2.2 结合常数与结合位点数

如果小分子与蛋白质二者之间的猝灭方式是静态的过程，可运用公式(4)对数据进一步计算得到API与SPI相互作用的结合常数Ka和结合位点数n[16]：

lg(F0-F)/F=lgKa+nlg[Q]

(4)

式中：F和F0分别表示加入了和还未加入API时SPI的荧光强度；Ka为表观结合常数，n为结合位点数，[Q]为API的浓度。

以lg[Q]为横坐标，lg(F0-F)/F为纵坐标作图，经过拟合后得到回归曲线(图4)，三条线的斜率即为结合位点数n，截距为lgKa，通过计算可得出表观结合常数Ka。如表1所示，n值近似为1，说明API于SPI上仅有一个结合位点；随着温度的上升，结合常数Ka呈现下降趋势，表明温度升高使SPI-API结合体系的稳定性下降。

2.3 热力学参数与作用力

小分子物质和蛋白质之间的相互作用力主要有疏水作用、范德华力、氢键和静电作用[17]。如果焓变为正值、熵变为正值，则两者之间主要是疏水作用；如果焓变为负值、熵变为负值，则两者之间主要是范德华力与氢键作用；如果焓变为负值，熵变为正值，则两者之间主要是静电作用[18]，可采用反应的焓变ΔH°和熵变ΔS°判断API与SPI之间的相互作用力类型。热力学参数可通过以下公式计算得出[19]：

图4 在25，31和37 ℃三个温度条件下API猝灭SPI的双对数图

(5)

ΔG°=ΔH°-TΔS°

(6)

公式(5)中R表示气体常数(8.31 J·mol-1·K-1)，T为热力学温度(298，304，310 K)，Ka为结合常数。计算得到的ΔH°、ΔS°和ΔG°值列于表1中。ΔG°<0，表明反应是自发进行的，ΔS°和ΔH°均<0，表明API与SPI的结合是一个放热的过程，二者之间的作用力主要是氢键和范德华力。

2.4 同步荧光光谱

同步荧光光谱法常用来探测小分子与蛋白质相互作用后对蛋白质氨基酸微环境的影响，波长差为15 nm显示的是酪氨酸残基的荧光光谱，波长差为60 nm显示的是色氨酸残基的荧光光谱，由此可判断API与SPI相互作用对两种氨基酸残基微环境的影响[20]，最大荧光发射峰的红移和蓝移分别表明对应氨基酸残基周围微环境的极性和疏水性变化[21]。

图5表示常温下SPI-API的同步荧光光谱图，从图中可以看出，随着API浓度的不断增大，酪氨酸、色氨酸的荧光强度都逐渐下降，最大发射峰位置都有稍许移动，其中酪氨酸的发射峰位从292 nm蓝移至290 nm，而色氨酸的发射峰位从285 nm红移至287 nm，表明API与SPI作用改变了SPI上的酪氨酸残基、色氨酸残基所处的微环境，酪氨酸残基周围微环境疏水性增加，而色氨酸残基周围微环境极性增加[22]。

(A) Δλ=15 nm

(B) Δλ=60 nm图5 25 ℃时SPI-API体系的同步荧光光谱图

2.5 三维荧光光谱分析

通过三维荧光光谱实验可以了解到更多的API对SPI构象影响的信息。如图6所示，peak1主要表示色氨酸和酪氨酸残基的内源荧光特征吸收峰，peak2主要反映蛋白质多肽链骨架结构的荧光特征吸收峰。通过向SPI中添加API，peak1和peak2的荧光强度显著降低，表明API与SPI的相互作用引起了多肽链一定程度的伸展，一部分包埋在分子内部的疏水性氨基酸残基暴露出来，从而导致蛋白质构象的改变[23]。

(A) SPI三维荧光光谱

(B) SPI-API复合物三维荧光光谱图6 SPI-API体系的三维荧光光谱图

2.6 紫外-可见吸收光谱分析

图7为向SPI溶液中依次滴加一定量的API后扫描出的紫外-可见吸收光谱图(已扣除相应的空白)。SPI在260 nm附近有一个强吸收峰，为蛋白质肽键的特征峰，反映蛋白质多肽链的变化。随着API浓度的增加，该吸收峰的强度逐渐增大并发生红移，表明API诱导SPI的肽链延伸，吸光度增加，构象发生改变[24]。

2.7 圆二色光谱分析

圆二色光谱可以用来测定API诱导的SPI的二级结构变化。在氮气环境条件下，测量[SPI]:[API]分别为1:0、1:2、1:16时，复合物的圆二色光谱。图8显示，在200～205 nm之间有一个负峰，代表着SPI的α-螺旋的特征峰[25]，随着API浓度的不断增加，SPI的CD强度不断产生微小减弱，峰的位置也有轻微的蓝移，表明API的加入对SPI的周围的疏水微环境和二级结构产生了影响[26]，通过网站Dichroweb在线软件可求出加入不同浓度API后SPI的二级结构(α-螺旋，β-折叠，β-转角和无规则卷曲)的含量。如表2所示，随着API浓度的升高，α-螺旋含量从24.66%降至18.16%，β-折叠含量从49.33%降至35.34%，β-转角含量从14.23%升至22.80%，无规则卷曲含量从11.69%升至23.69%，α-螺旋含量的减少表明了API与SPI结合后会导致蛋白质多肽链部分伸展，使其暴露在疏水性环境中[27]。

λ=15 nm

λ=15 nm

表2 不同浓度API-SPI体系的二级结构含量

2.8 API对蛋白质表面疏水性的影响

蛋白质的表面疏水性是蛋白质的重要特性参数，在维持蛋白质的构象和生物活性方面起到重要的作用[28]，采用ANS荧光探针法测定蛋白质的疏水性。

如图9所示，5条曲线分别代表加入的芹菜素浓度为0，6.17，12.33，18.5，24.67×10-6mol·L-1，随着芹菜素浓度的增加，5条曲线的斜率逐渐降低，大豆分离蛋白表面疏水性指数S0逐渐下降，表明随着加入芹菜素浓度的增大，SPI与ANS的解离能力增强，结合能力降低，ANS会更难与SPI结合，API与SPI结合会使SPI疏水性性能下降，且溶液中API浓度越大，疏水性降低越明显[14]。

SPI/(mg·mL-1)图9 API对ANS-SPI体系中荧光强度的影响

2.9 API对SPI游离巯基含量的影响

巯基是蛋白质的重要功能性基团，巯基具有抗氧化、亚硝基化、巯基-二硫键交换等作用。如图11所示，随着API含量的增加，SPI游离巯基含量明显上升，可能是因为与API作用，使SPI的半胱氨酸残基暴露，巯基含量增加。

API/(10-6 mol·L-1)

2.10 分子模拟

分子模拟是利用计算机以原子水平的分子模型来模拟分子的结构和作用力[29]，通过分子模拟可以直观地展示API与SPI的相互作用的结合模式和结合位点[30]。大豆分离蛋白不是纯蛋白，其中主要成分为7s型蛋白与11s型蛋白，故分别选择7s与11s型蛋白与芹菜素进行结合分析。

如图12所示，API分子插入了SPI-7s的疏水空腔中，并且被LEU226，GLN77，THR75，HIS76，ASN74等氨基酸包围，同时，API分子与氨基酸残基HIS76，ANS74形成2个氢键，键长分别为3.43Å与4.59Å。如图13，API分子插入SPI-11s中，被THR353，THR328，MET329，LEU354，ASP342，LYS113，THR358，LYS330等氨基酸包围，同时，API分子与氨基酸残基ARG340，LYS330，THR358，THR328，SER339形成氢键，键长分别为5.77Å，5.27Å，4.55Å，4.21Å，3.333Å。这可能是由于API本身含有3个羟基，易形成氢键，表明API与SPI的结合作用力主要是由范德华力和氢键，这与热力学分析结果相吻合。

图11 API与SPI-7s的结合模式图

图12 API与SPI-11s的结合模式图

3 结论

本文采取了多种光谱学方法结合分子模拟技术对API与SPI的相互作用进行了研究，结果表明，API与SPI能够形成复合物，其结合常数在103数量级，API的加入能使SPI的内源荧光发生静态猝灭，氢键和范德华力是二者结合过程中的主要驱动力。API的加入降低了SPI的表面疏水性，增加了巯基含量，使SPI上的酪氨酸残基与色氨酸残基所处的微环境极性和疏水性发生改变，导致SPI的α-螺旋含量从24.66%降至18.16%，β-折叠含量从49.33%降至35.34%，β-转角含量从14.23%升至22.80%，无规则卷曲含量从11.69%升至23.69%，SPI结构变得更加疏松。分子模拟显示API分子插入到SPI的疏水空腔中，API分子与SPI-7s的氨基酸残基HIS76，ANS74形成2个氢键，与SPI-11s的氨基酸残基ARG340，LYS330，THR358，THR328和SER339形成氢键。