串联质谱技术在新生儿遗传代谢病筛查中的应用分析

郑国兵 梁睿 唐家彦 王德刚 梁少霞 谢丰华

作者单位：1.中山市博爱医院产前诊断中心，广东，中山528400

2.中山市博爱医院儿科，广东，中山528400

遗传代谢病（Inherited metabolic disease，IMD）是因机体各代谢途径部分酶缺陷，造成毒副产物过度堆积或必要代谢产物合成不足，而出现各种临床症状的一组疾病［1-3］。该病虽单一病种发病率较低，但总体发病率及死亡率不低［4-5］。有研究报道，部分IMD 具有严重致死性，而另一部分存活患者，如不能在中枢系统发育之前或出现严重症状之前给予有效治疗，将难以达到理想治疗效果［6-7］。因此临床对IMD 早发现、早治疗十分重要。但常规筛查方式，由于体内生化代谢物浓度受疾病、药物、饮食等因素影响而不断变化，因此检查结果具有一定不确定性。串联质谱技术（Tandem mass spectrometry，MS/MS）可在2～3 min 检测几十种分子代谢产物，从而实现40 多种IMD 筛查［8-9］，继而通过分子手段找到致病基因与致病突变，但目前国内有关分子检测研究报道较少。本研究探讨MS/MS 在IMD 筛查中的应用价值。现报道如下。

1 一般资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年10月至2020年10月于中山市博爱医院产前中心就诊的新生儿70 509 例，采用MS/MS 术筛查其遗传代谢性疾病。接受MS/MS筛查的新生儿中，男39 364 例（55.83%），女31 145（44.17%）；足月儿（37～42）周68 543 例（97.21%），早产儿（＜37 周）1 966 例（2.79%）；采血日龄平均（5.48±1.76）天；体重平均（3.52±1.49）kg；正常体重（2.5～4）kg 新生儿60 542 例（85.87%），体重偏低（＜2.5 kg）新生儿3 480 例（4.93%），巨大儿（＞4 kg）6 487 例（9.20%）；单胎为69 959 例（99.22%），多胎550 例（0.78%）；来自乡镇地区为8 855 例（12.56%）。纳入标准：本院产前中心自愿接受IMD 筛查者。排除标准：①出生时出现窒息、产伤、颅内出血患儿。②药物或母亲原性肉碱缺乏等继发因素造成IMD者。③芯片检测拷贝数据异常或染色体G 显带异常的已知IMD 综合征患儿。本研究经医院医学伦理会委员批准，新生儿家属均知情，且签订同意书。

1.2 方法

1.2.1 采集标本

新生儿充分喂养后3 天，采集其足跟血及末梢血于专用筛查滤纸，血斑直径＞8 mm，常温下阴干，再将滤纸片送往新生儿疾病筛查中心待检。

1.2.2 使用仪器与试剂

串联质谱检测：采用美国Wocters 公司的TQD 质谱仪，采用PE 公司NeoBuseTMNon-derivati zed MSMS Kit 非衍生化多种肉碱、琥珀酰丙酮、及氨基酸试剂盒及配套试剂检测。试剂盒涵盖13 种同位素标记的酰基肉碱及游离肉碱标准品。基因测序检测：利用核酸（DNA）提取试剂盒（由艾康生物技术（杭州）有限公司提供）提取基因组DNA，及基因测序仪NextSeqCN500 对富集文库进行高通量测序。

1.2.3 实验室检测

串联质谱：从血滤纸片中取出直径为3 mm 的圆形滤纸片，放于96 孔聚丙烯版（试剂盒由北京泰泽嘉业科技发展有限公司提供）中进行肉碱、非衍生化多种氨基酸、及琥珀酰丙酮测定。非衍生化法：将100 μL 同位素内标的酰基肉碱与氨基酸加入孔中，运用微孔板封膜将其密封，震荡萃取40 min，取70 μL 上清液加入96 孔聚丙烯板中，运用铝膜将其覆盖，上样检测。基因测序检测：运用基因序列捕获技术将患儿全基因组文库与IMD 常见致病基因捕获探针混合。当致病基因附着于探针上后，用洗脱方式洗掉非目标区域DNA 片段。对目标区域进行测序，再用Trim-Galore 程序处理便可获得读数。

1.2.4 召回及确诊可疑阳性标本

通过电话及时召回筛查结果为可疑阳性新生儿，重新采集标本进行MS/MS 检测。如第二次检测依然呈阳性的标本，需及时送检分析其基因突变，本次研究中663 例可疑阳性新生儿均接受定期检测与随访，无失访现象发生。

1.3 统计分析

运用EXCEL 表格汇总数据；可疑阳性率用n（%）表示，通过可疑阳性例数/总筛查例数计算出可疑阳性率；阳性总发病率、发病率及总发病率均用1/n 表示，通过等式：阳性确诊例数/总筛查例数=1/n 可得出n 值；总构成比用n（%）表示，各类型遗传代谢性疾病确诊例数/总确诊例数，可得出不同类型代谢性疾病在总确诊例数中的构成比。

2 结果

2.1 串联质谱筛查阳性初筛率及阳性确诊率

在参与筛查的70 509 例新生儿中，初筛住院阳性患儿为663 例，门诊阳性患儿为26 例，阳性初筛率为0.98%，成功召回689 例，成功召回率为100%。被召回阳性可疑新生儿再次进行MS/MS 检测，56 例依旧阳性，56 例患儿依据不同阳性可疑病种，均进行基因诊断与鉴别诊断，最终30 例新生儿确诊为IMD，总发病率为1/2 350。在689 例初筛阳性新生儿中，最终确诊仅为30 例，假阳性率为0.93%。其中有机酸代谢异常6 例，脂肪酸代谢异常8 例，氨基酸代谢异常16 例。见表1。

表1 串联质谱筛查阳性初筛率及阳性确诊率［n（%）］Table 1 Specific conditions of tandem mass spectrometry screening in children with positive diagnosis［n（%）］

2.2 阳性确诊患儿串联质谱筛查具体情况

30 例确诊病例中，有机酸代谢障碍6 例，即3羟-3 甲基戊二酸酸尿症（3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria，HMG）、异丁酰辅酶脱羟酶A 缺乏症（Isobutyryl coenzyme dehydroxylase a deficiency，IBDD）、全羟化酶合成酶不足（Total hydroxylase synthase deficiency，HLCS）各1 例，甲基丙二酸血症（Methylmalonic acidemia，MMA）3 例；脂肪酸代谢障碍8 例，即短酰基辅酶脱羟酶A 缺乏症（Short acyl coenzyme dehydroxylase a deficiency，SCADD3）3 例、原发性肉碱缺乏症（Hypermethylsulfatemia primary carnitine deficiency，PCD）5 例；氨基酸代谢障碍16 例，即鸟氨酸血症（Ornithinemia，ORN）、Ⅰ型瓜氨酸血症（Citrullinemia type I，CTLN1）各1 例，高甲基硫酸血症（Hypermethylsulfaemia，MIM）4 例高丙氨酸血症（Hyperalaninemia，HPA）12 例。见表2。

表2 阳性确诊患儿串联质谱筛查具体情况Table 2 specific conditions of tandem mass spectrometry screening in children with positive diagnosis

2.3 串联质谱筛查技术优势

串联质谱技术筛查病种丰富，筛查项目齐全，可实现对18 种氨基酸代谢性疾病、14 种有机酸代谢性疾病及14 种脂肪酸代谢性疾病的筛查。该技术筛查时间仅需5 h 左右。

3 讨论

遗传代谢性疾病治疗难度较大，其治疗效果与干预时间密切相关［10-11］。近年来遗传代谢性疾病随着新生儿出生缺陷率增加，有逐渐上涨趋势，严重影响患儿身心健康，并对患儿家庭造成巨大经济负担。因此早期对新生儿遗传代谢性疾病进行筛查十分重要。从1981年我国首次开展新生儿疾病筛查以来，纳入普筛的疾病为先天性甲状腺功能降低症。随着串联质谱技术及配套筛查试剂的发展，可筛疾病已达到40 余种，这将推动更多疾病纳入普筛项目［12-13］。串联质谱技术能对多种疾病、多种指标进行筛查，能在2 min 内实现多种游离肉碱、氨基酸、及酰基肉碱的检测［14］。

本研究对70 509 例新生儿采用串联质谱技术进行遗传代谢性疾病筛查，可疑阳性为663 例，其中30 例被最终确诊，总发病率达1/2 350，高于浙江地区1/5 626 的发病率，上海地区1/3 529 的发病率，盐城地区1/4 384 的发病率，但低于淄博市1/1 683的发病率、及郑州地区0.1%的发病率［14］。由此得出，遗传代谢性疾病分布具有显著地区差异性，分析原因可能为，不同地区采集标本方式、筛查标准、及基因多态性分布差异造成。本地区总体来说，为比较高发地区。因此对本地区新生儿遗传代谢性疾病，运用串联质谱技术进行筛查十分必要。

本文研究结果还表明，串联质谱技术具有筛查病种丰富、筛查项目齐全及筛查时间短的特点。因为串联质谱技术具有高选择性、高特异性、及高灵敏度等优良性能，因此在检测新生儿代谢疾病领域具有显著优势。本研究串联质谱具体检测结果显示，高丙氨酸血症（PHA），为氨基酸代谢障碍疾病中多发疾病。该病多为丙氨酸羟化酶突变造成相关酶活性降低而引发，临床主要表现为小脑共济失调、视神经萎缩，肌张力降低等。

值得注意的是，本研究采用串联质谱技术对新生儿代谢疾病进行筛查，假阳性率高达0.93%，相关研究指出，提升筛查性能，加强筛查质量管理，降低筛查假阳性率。可通过保证血片质量、控制实验流程、检验程序、实验室评估、判读方法等质量，及互相交流与数据共享，加强实验室及区域协作而实现。因此通过严格质量把控，与交流协作可降低串联质谱技术筛查假阳性率。

综上所述，新生儿遗传代谢性疾病采用串联质谱技术进行筛查可提高筛查有效性与准确率。串联质谱技术能对遗传代谢性疾病早发现，为后续治疗赢得宝贵时间，从而改善患儿预后效果，使我国出生人口综合质量得到提高。且串联质技术具有筛查病种丰富，筛查项目齐全，且筛查时间短的特点。因此串联质谱技术筛查新生儿遗传代谢性疾病具有推广价值。