青海湖裸鲤klf2基因的克隆与功能初步分析

闵倩雯， 周其椿*， 熊 伟， 张显波， 李建光， 曾 圣， 陈飞雄， 杨 兴

(1.贵州省农业科学院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省特种水产工程技术中心， 贵州 贵阳 550025； 3.贵州省水产技术推广站， 贵州 贵阳 550025)

0 引言

【研究意义】青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)属鲤形目鲤科裂腹鱼亚科裸鲤属，俗称湟鱼。因青海湖特殊的地理及水体环境而使青海湖裸鲤具有无鳞、耐高寒、耐盐碱、杂食性的生物学特性及很强的适应能力。其肉质细嫩、鲜美，有很高的经济价值，1964年被水产部列为国家重要的水生经济动物。近年来，由于自然和人为的因素影响，青海湖裸鲤资源急剧下降。为保护青海湖裸鲤种群资源恢复，多项科学技术研究已取得多方面突破。2011年，青海湖裸鲤救护中心成功完成“青海湖裸鲤淡水全人工养殖技术研究”项目[1]，为开展引进这种高原冷水性鱼类积累了技术资料。对青海湖裸鲤展开生殖生理学研究，对解析其性腺发育机制具有重要意义，并可为其人工扩繁和分子遗传育种研究奠定理论基础。【前人研究进展】Kruppel样转录因子(klfs)是一类重要的调控因子，参与胚胎发生过程中的各种生物学过程。Klf家族成员的特征是C端锌指结构为3个连续的Cys2/His2结构分别螯合1个Zn2+组成，其锌指结构可与DNA分子上的GT盒或CACCC序列结合发挥作用[2]。klf2(Kruppel-like factor-2)是Kruppel家族的重要成员，可参与多种细胞增殖、分化调控；不仅广泛表达于血管内皮[3]，还表达于心[4]、肝[5]、肾[6]等重要器官，在各种生理和炎症性疾病及其发病机制中也起着重要的调节作用[7-8]。JHA等[8-9]研究表明，klf2缺陷型小鼠于产前阶段死亡，表明klf2基因在胚胎发育过程中的关键作用。然而，klf2基因在裸鲤中的功能和作用还未见研究报道。【研究切入点】围绕青海湖裸鲤卵巢中klf2基因的克隆和功能开展相关研究。以青海湖裸鲤为研究对象，克隆klf2 cDNA全长序列；基于多物种klf2基因的氨基酸序列，应用生物信息学方法比较分析klf2基因的系统进化关系，利用RT-PC和realtime-QPCR检测青海湖裸鲤各组织klf2基因的表达情况。【拟解决的关键问题】首次克隆出青海湖裸鲤klf2 cDNA全长序列，多物种比对构建裸鲤klf2基因的系统发育进化树。分析裸鲤klf2基因在各组织分布表达情况，以及对于klf2基因在裸鲤性腺中存在的雌雄差异表达，以得出klf2基因在裸鲤卵巢发育过程中可能的调控作用。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

青海湖裸鲤从青海湖裸鲤救护中心引进，在贵州省农业科学院水产研究所试验基地培育，于自然光周期下在22℃的恒温循环水系统中饲养。投喂汉业饲料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鲤klf2基因克隆

根据GenBank中报道的相关物种klf2的基因序列，在基因保守区域设计合成简并引物，对klf2部分基因片段扩增及测序，获取青海湖裸鲤klf2基因中间部分序列，并通过5′-和3′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)测序验证及序列比对获取klf2基因全序列。

1.3 klf2基因的系统进化分析

从NCBI的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载包括人在内的14个物种klf2基因氨基酸序列(表1)，对14个不同物种及克隆的青海湖裸鲤的klf2氨基酸序列，应用MEGA 6.0以NJ法构建系统进化树。斑马鱼klf17(NP_571798.1)氨基酸序列作为外类群。

表1 不同物种klf2 基因氨基酸序列

1.4 脊椎动物klf2 基因共线性分析

在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)分析构建脊椎动物klf2基因及其相邻基因图谱研究。

1.5 青海湖裸鲤klf2 基因组织表达模式分析

解剖24月龄裸鲤，取脑等11个组织于液氮速冻。按照RNAiso Plus操作说明提取总RNA，逆转录合成cDNA，用基因特异引物扩增，检验klf2基因在各组织中的分布情况。

1.6 青海湖裸鲤klf2 基因在各时期卵巢中的表达

取3月龄、6月龄、9月龄、12月龄、18月龄及24月龄的青海湖裸鲤卵巢液氮速冻，提取总RNA，逆转录合成cDNA。采用Real-time PCR检测klf2基因在各时期裸鲤卵巢中的表达情况。管家基因β-actin作为内参，目标基因mRNA的相对表达水平采用公式R=2-△△Ct方法计算[10]，结果表示为Ct值的平均值±标准偏差(Mean±SD)，应用SPSS进行差异显著性分析，显著性水平P<0.05。

2 结果与分析

2.1 青海湖裸鲤klf2 cDNA和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析显示，青海湖裸鲤klf2全长cDNA序列为2 183 bp，包括5′端249 bp的非编码区，1 104 bp的蛋白质编码区和3′端830 bp非编码区；开放阅读框编码367个氨基酸(图1)。

图1 青海湖裸鲤 klf2 cDNA全序列及推导的氨基酸序列

2.2 脊椎动物klf2 基因序列对比及系统进化聚类结果

通过氨基酸序列比对，klf2基因在脊椎动物间有高度相似性，具有保守的zf-H2C2_2结构域。从图2看出，克隆的青海湖裸鲤klf2与人、小鼠、鸡、蜥蜴、爪蟾、腔棘鱼、斑点雀鳝、红鳍东方鲀、青鳉、罗非鱼、斑马鱼、金鱼、金线鲃、鲤鱼klf2基因间的氨基酸序列相似性分别为49.8%、49.5%、58.1%、47.0%、59.8%、58.5%、70.9%、68.4%、67.7%、68.5%、85.6%、91.3%、95.1%、93.5%。

图2 脊椎动物klf2氨基酸序列比对

根据系统进化树分析结果(图3)，四足类、人、小鼠、蜥蜴的klf2基因氨基酸序列聚为一支；鸡、爪蟾、腔棘鱼的klf2基因氨基酸序列聚为一支；鱼类红鳍东方鲀、青鳉、罗非鱼、斑点雀鳝、金鱼、鲤鱼、斑马鱼、金线鲃、青海湖裸鲤的klf2基因蛋白序列聚为一支。

图3 基于氨基酸序列的klf2系统进化树

2.3 脊椎动物klf2基因的共线性

共线性分析结果(图4)显示，klf2基因与其邻近基因eps15l1、calr3、ap1m1、tpm4在人、小鼠、鸡、蜥蜴中的共线性高度保守，与爪蟾的calr3、ap1m1、tpm4不共线；在部分鱼类中，klf2基因与其邻近基因eps15l1、calr3、ap1m1、tpm4高度保守；与腔棘鱼的ap1m1、tpm4不共线；与斑点雀鳝、罗非鱼和金线鲃tpm4不共线。

图4 脊椎动物 klf2基因共线性

2.4 青海湖裸鲤klf2 组织表达模式

RT-PCR分析结果(图5)表明，青海湖裸鲤klf2基因在成鱼各组织中表达存在雌雄差异，雌性个体中klf2基因高量表达于卵巢，且在垂体、鳃、心脏、脾脏中存在中量表达，在头肾、肾中存在微量表达；雄性个体中klf2基因在垂体、鳃、心脏、脾脏、头肾、肾中存在微量表达。

图5 青海湖裸鲤klf2 基因组织表达模式

2.5 青海湖裸鲤 klf2基因在卵巢不同发育阶段的表达

Real-time PCR分析(图6)发现，klf2在3月龄、6月龄、9月龄、12月龄、18月龄及24月龄卵巢中均存在表达，随月龄增大klf2的相对表达量呈增加趋势，表现为3月龄<6月龄<9月龄<12月龄<18月龄<24月龄，其中，3月龄表达量显著低于其余处理；在6月龄、9月龄和12月龄持续显著升高，后期持续高量表达。

图6 青海湖裸鲤 klf2基因在卵巢不同发育>阶段的表达水平

3 讨论

研究成功克隆了青海湖裸鲤klf2基因，克隆的klf2基因具有保守的zf-H2C2_2结构域。系统进化树分析显示，以斑马鱼klf17作为外类群，克隆的klf2基因与其他脊椎动物的klf2聚为一支，且klf2基因序列同源性最低为47.0%，最高达95.1%。共线性分析显示，四足类和鱼类klf2基因及相邻基因的共线性较为保守。

klf2作为转录因子，在生物的多种信号通路和器官发育中其重要作用。研究结果显示，klf2在检测的青海湖裸鲤的多个组织中有表达，说明该基因的功能是多元化的。研究首次在鱼类卵巢中对该基因的表达功能研究发现，klf2在整个青海湖裸鲤卵巢发育后期表达持续升高，并在性成熟的卵巢保持较高水平的表达，3月龄雌性青海湖裸鲤卵巢开始进行减数分裂，一般人工养殖条件下24月龄能够达到性成熟。从卵巢减数分裂起始至卵巢发育成熟，klf2都存在持续升高的表达，说明鱼类klf2可能在卵巢发育过程和卵子发生过程都扮演重要角色，但其具体功能和作用机制，还有待进一步研究。贵州省冷水资源量巨大，水质良好，水温常年稳定在11～25℃，适宜养殖高品质冷水性鱼类，十分适宜青海湖裸鲤产业发展。研究结果为进一步了解klf2基因的作用和机理提供了基础信息，同时为青海湖裸鲤的人工繁殖和遗传育种提供了理论基础。

4 结论

采用cDNA末端快速扩增法首次克隆获得青海湖裸鲤klf2基因全长cDNA序列，克隆的klf2基因具有保守的zf-H2C2_2结构域；其与其他脊椎动物的klf2基因聚为一支，四足类和鱼类klf2基因及相邻基因的共线性较为保守。采用生物信息学对该基因及其编码蛋白进行预测分析,并采用RT-PCR和实时荧光定量PCR法检测出青海湖裸鲤各组织klf2基因的差异表达。生物信息学及表达研究分析表明，klf2基因可能在青海湖裸鲤的卵巢发育和卵子发生过程起重要作用。研究结果将为进一步开展klf2基因在青海湖裸鲤卵巢发育的分子调节机理研究中应用提供基础数据。