贵州山豆根根腐病病原菌鉴定

唐小迪 魏升华 秦睿 崔文艳 何朋杰

摘要：【目的】明確贵州山豆根根腐病的病原菌种类，为山豆根根腐病的防治及抗病育种提供理论基础。【方法】采用保湿培养法和组织分离法对感染根腐病的山豆根植株组织进行病原菌分离和纯化，根据柯赫氏法则对代表性菌株进行致病力测定;结合形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定。【结果】从收集的病株组织样本中共分离获得200株真菌菌株，选取在PDA培养基上菌落形态差异明显的67株菌株进行ITS测序并在NCBI数据库进行BLASTn比对分析，结果显示，67株菌株中包含尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）35株、茄腐镰刀菌（F. solani）7株、粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）23株和帚状弯孢聚壳（Eutypella scoparia）2株。致病性测定结果表明，尖孢镰刀菌代表性菌株和茄腐镰刀菌代表性菌株均可侵染山豆根引起典型的根腐病症状，且茄腐镰刀菌致病性明显强于尖孢镰刀菌。结合形态学特征和分子生物学鉴定结果，确认分离得到的病原菌分别为尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌。【结论】贵州山豆根根腐病主要由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌复合侵染引起。

关键词：山豆根;根腐病;茄腐镰刀菌;尖孢镰刀菌;鉴定;贵州省

中图分类号：S435.67                           文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2140-08

Identification of pathogen causing root rot of

Sophora tonkinensis Radix in Guizhou

TANG Xiao-di1， WEI Sheng-hua1， QIN Rui2， CUI Wen-yan1， HE Peng-jie1*

（1Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang  550025， China; 2Ziyun Autonomous County Changmeng Agricultural Science and Technology Development Co.， Ltd.， Anshun， Guizhou  550800， China）

Abstract：【Objective】To identify the pathogen causing root rot of Sophora tonkinensis Radix in Guizhou， and to provide a theoretical basis for disease control of S. tonkinensis Radix root rot and for breeding resistant varieties. 【Method】The pathogen causing root rot on S. tonkinensis Radix was isolated and purified from plant samples with root rot disease symptoms. The pathogenicity of representative strains were determined according to Kochs law， and the pathogen strains were identified by morphological characterization and molecular biology. 【Result】According to the collected diseased plant tissues， a total of 200 fungal isolates were obtained from 23 strains out of 67 strains collected， and 67 of them with different growth and morphology characters were selected for ITS sequencing on PDA media， and BLASTN comparison was conducted in NCBI database. There were 35 strains of Fusarium oxysporum， 7 strains of F. solani， 23 strains of Clonostachys rose and 2 strains of Eutypella scoparia. The results of pathogenicity test revealed that representative strains of F. oxysporum and F. solani could infect the root of S. tonkinensis Radix and cause typical symptoms of root rot， and F. solani showed stronger pathogenicity compared with F. oxysporum. In addition， combined with morphological characteristics and molecular biological identification results， the isolated fungal pathogens were identified as F. oxysporum and F. solani， respectively. 【Conclusion】The root rot of S. tonkinensis Radix in Guizhou is mainly caused by simultaneous infection of F. oxysporum and F. solani.

Key words： Sophora tonkinensis Radix; root rot; Fusarium oxysporum; Fusarium solani; identification; Guizhou

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2018YFC1708101）

0 引言

【研究意义】山豆根（Sophorae tonkinensis Radix）又名越南槐、广豆根，是豆科植物越南槐的干燥根和根状茎，是我国重要的药用植物之一（Cai et al.，2018;Ning et al.，2021）。山豆根入药后具有清热解毒、消肿利咽的功效，临床上常用于治疗急性咽喉炎和咽喉痛（Ning et al.，2021）。近年来，由于野生资源枯竭，山豆根主要以大面积人工种植为主。自2015年以来，贵州省结合制药企业对山豆根原材料的需求，先后在紫云县、兴义市、册享县和平坝区等地人工种植山豆根667 ha，发现其从种子萌发到采收均容易感染根腐病，尤其在夏秋雨季后发病率最高，且传染性极强，造成药材质量和产量的下降。鉴于根腐病对贵州省山豆根产业的严重威胁，亟需对其开展系统研究。【前人研究进展】根腐病是由多种病原物侵染引起植物根部腐烂病害的总称，是一类典型的土传病害（Basallote-Ureba et al.，2016;Lecomte et al.，2016;Zhang et al.，2016）。在豆科植物中，根腐病主要由真菌和细菌等病原菌引起，且在田间常表现为由不同病原菌复合侵染引起（Misk and Franco，2011;高芬等，2015）。在我国，豆科中草药根腐病主要由镰刀菌属（Fusarium spp.）真菌单独或复合侵染引起（Chang et al.，2018;Wang et al.，2021），如引起甘草根腐病的主要致病菌为茄腐镰刀菌（F. solani）、尖孢镰刀菌（F. oxysporum）和层出镰刀菌（F. proliferatum）（曹雪梅等，2014）;引起宁夏六盘山地区蒙古黄芪根腐病的病原菌为尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和串珠镰刀菌（F. moniliforme）（何晨，2015）。周默和白庆荣（2021）对内蒙古莫旗黄芪根腐病病原菌开展研究，证实其主要致病菌为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌（F. solani）、锐顶镰刀菌（F. acuminatum）和木贼镰刀菌（F. equisetim），与何晨（2015）对宁夏六盘山地区蒙古黄芪根腐病病原菌分离的种类有所不同，说明中草药根腐病不仅不同寄主的病原菌种类不同，不同产地罹患根腐病的同种中草药优势致病菌也存在差异，甚至同一地区不同年份因生态条件不同，其优势菌种类也可能发生变化。不同的分离方法也会导致不同的结果，刘奕君（2017）采用常规组织分离法从广西发生甘薯疮痂病典型症状叶片上分离获得的真菌接种甘薯未见疮痂病发病症状，未能分离到病原菌;于琳等（2020）采用分生孢子悬液梯度稀释分离法分离病原菌，发现广东甘薯疮痂病的病原菌为甘薯痂囊腔菌（Elsinoe batatas）。【本研究切入点】目前，国内尚无针对贵州山豆根根腐病的研究，对引发该病的病原菌尚不明确。【拟解决的关键问题】对贵州山豆根种植基地的根腐病发病情况进行调查，初步明确该病害的发生规律;收集典型病株发病组织，通过保湿培养法和组织分离法进行优势微生物分离和纯化，根据柯赫氏法则对代表性菌株进行致病力测定;结合形态学和分子生物学鉴定，确定贵州山豆根根腐病的病原菌種类及生物学和系统发育学特征，为山豆根根腐病的防治及抗病育种打下理论基础。

1 材料与方法

1. 1 病害调查与样品采集

2020年8—9月，于贵州省紫云县中草药种植基地（海拔1170 m，北纬25°53′6″，东经106°4′9″）对山豆根根腐病发生情况进行调查。采用5点取样法，每点随机调查3株山豆根植株，共采集15株样本，统计并计算山豆根根腐病的发病率。采集典型发病植株，装于自封袋中带回实验室，于4 ℃下保存备用。

1. 2 供试培养基

PDA培养基：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水1 L，pH 7.0。VBC培养基：KH2PO4 2.0 g，KNO3 1.0 g，蔗糖0.5 g，维生素B l片，维生素C l片，琼脂18.0 g，蒸馏水1 L;不加琼脂即为液体培养基。

1. 3 病原菌的分离、纯化与保存

1. 3. 1 保湿培养法分离和纯化病原真菌 用无菌剪刀剪切发病山豆根根系样本，无菌水漂洗干净。经表面消毒（5%次氯酸钠溶液消毒1 min，75%乙醇溶液消毒1 min）后将根系样本用无菌解剖刀和镊子切成小片，随机平铺在含有抗生素（氯霉素10 μg/mL，红霉素25 μg/mL）的PDA固体培养基中央，每个PDA平板放置1块，置于28 ℃恒温培养箱中静置培养7 d。根据所形成的丝状真菌形态，挑取丝状真菌单菌落接种于PDA培养基上进行初次纯化。挑取初次纯化所得单菌落接种于PDA培养基上进行二次纯化，28 ℃静置培养72 h，观察培养基上所形成的菌落形态特征。最后用无菌刀片连同菌丝和固体培养基一起切块放入装有20%甘油的冻存管中于-20 ℃保存备用。

1. 3. 2 组织分离法分离和纯化病原真菌 取染病山豆根组织块于灭菌研钵中，加入适量无菌水用力研磨，使组织尽可能地磨碎;用梯度稀释法将所得研磨液分别稀释103、104、105和106倍;用移液枪吸取300 μL稀释液涂布至含有抗生素（氯霉素10 μg/mL，红霉素25 μg/mL）的PDA培养基中，涂布均匀后置于28 ℃培养箱中静置培养7 d。按照1.3.1的方法分离和纯化并保存病原菌菌株。

1. 4 病原菌分子生物学鉴定

取保藏的菌株于新鲜的PDA培养基上28 ℃恒温活化培养7 d，收集菌丝后加入液氮研磨，使用生工生物工程（上海）股份有限公司的真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取各分离菌株的基因组DNA，于-20 ℃保存备用。

使用特异性引物对ITS1/ITS4（ITS1：5'-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3';ITS4：5'-TCCTCCGCTTA TTGATATGC-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系20 μL：Mix 10 μL（百泰克生物技术有限公司），正、反向引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min 30 s;94 ℃ 40 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。获得的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的代表性菌株序列在NCBI数据库中用BLASTn进行比对分析，利用MEGA 7.0的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树，确定代表性菌株的分类学地位。

1. 5 病原菌致病性检测

1. 5. 1 孢子的制备 根据1.4的分子生物学鉴定结果，选取代表性菌株接种于VBC培养基上28 ℃恒温活化培养5 d，然后加入适量的无菌水洗脱孢子，收集孢子洗脱液后用血球计数板计数，用无菌水调节孢子浓度为1.0×106个/mL的孢子悬浮液，现配现用（张礼维，2015）。

1. 5. 2 离体山豆根组织接种 取健康山豆根根系经表面消毒后用无菌解剖刀切成5 mm厚的薄片，置于预先铺有2层无菌滤纸的培养皿中;向各培养皿加入约10 mL无菌水，以保持滤纸湿润;用移液枪吸取待检测各菌株孢子悬浮液10 μL分别接种于山豆根切片表面，以接种无菌水为阴性对照，每皿放置3片组织薄片，每处理6次重复。将培养皿置于28 ℃恒温培养箱中保湿培养，分别于培养第3和第7 d观察并记录发病情况。

1. 5. 3 活体植物接种 试验在昼/夜温度约32 ℃/24 ℃的温室内进行。将1年生健康山豆根苗移栽至预装有400 g无菌土的花盆（10 cm×8 cm）中，每盆种植1株，每处理种植10盆;移栽缓苗5 d后用针头在土壤交界处的根茎部位刺1个小伤口，随后将孢子悬浮液浇灌至植株根际（陈茂婷等，2020），每盆接种80 mL。每天观察并记录山豆根发病情况，分别于第6和第12 d计算根腐病发病率和病情指数。参考李伟等（2011）的分级标准将山豆根根腐病按发病程度分为0～4级：0级，无发病症状;1级，发病叶片占全株的1/4以下;2级，发病叶片占全株的1/4～1/2;3级，发病叶片占全株的1/2～3/4;4级，发病叶片占全株的3/4以上。

发病率（%）=病株数/调查总株数×100

病情指数=Σ（各级病株数×相对级数值）/调查

总株数×100

1. 6 病原菌形态观察

1. 6. 1 菌落形态观察和菌丝生长速度测定 选取具有较强致病性的代表菌株于PDA培养基中28 ℃恒温活化培养5 d，用无菌打孔器（直径6 mm）在菌落边缘打取菌丝块，接种至新的PDA培养基中央。将PDA置于28 ℃恒温培养箱中静置培养，每日观察和记录菌落形态。分析各菌株菌落的质地、菌落形成是否凸起、菌落正/反面颜色以及有无色素渗入培养基等。每株菌株设4个重复。

1. 6. 2 产孢细胞形态观察和分生孢子大小测定

选取活化培养7 d的代表性菌株，用无菌镊子夹取菌落表面气生菌丝，置于光学显微镜下观察产孢细胞和孢子形态。参照1.5.1的方法制备孢子悬浮液，用滴管吸取适量孢子悬浮液于载玻片上，盖上盖玻片，转移至光学显微镜下观察，每株菌株制备3个装片。于显微镜下每个装片随机选择5个视野（100×），每个视野随机挑取10个孢子，记录并计算孢子大小。

1. 7 统计分析

试验数据运用Excel 2010进行统计，运用SPSS 22.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncans新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2. 1 山豆根根腐病的危害与症状特点

山豆根从种子萌发到采收约需4年，整个种植期内均可发生根腐病。一般夏、秋雨季（温度17～32 ℃）植株最易被侵染，田间发病率达15%～40%，死亡率约10%，危害极为严重。该病主要危害山豆根的根茎部位，染病部位从根上部逐渐感染至根下部，地上部分表现为叶片变黄、细小，直至整株变黄、萎蔫，甚至全株枯死（图1）。

2. 2 病原菌分离与ITS序列比对分析结果

从收集的病株组织中共分离得到200株真菌菌株。根据获得的真菌菌株在PDA培养基上的菌落特征，选取菌落形态差异明显的67株菌株进行分子生物学鉴定。将测序获得的ITS序列提交至NCBI數据库进行BLASTn比对分析，结果（表1）显示，67株菌株中有35株尖孢镰刀菌，其分离率最高，为52.24%，其余依次为粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）（23株，分离率34.33%）、茄腐镰刀菌（7株，分离率10.45%）和帚状弯孢聚壳（Eutypella scoparia）（2株，分离率2.99%）。

2. 3 病原菌对山豆根的致病性检测结果

2. 3. 1 离体组织致病性测定 将4种真菌的代表性菌株（帚状弯孢聚壳菌菌株26-7、粉红粘帚霉菌菌株30-8、尖孢镰刀菌菌株13-13和茄腐镰刀菌菌株27-15）孢子悬浮液接种至山豆根根切片表面，于培养第3和第7 d观察并记录离体组织的变化。结果（图2）表明，不同处理间差异明显，其中无菌水对照组、菌株26-7和菌株30-8处理组的根切片培养7 d后未观察到病变现象，根切片表面无菌丝体;菌株13-13和菌株27-15处理组培养7 d后山豆根离体组织表面发生明显病变或观察到大量的菌丝体存在。菌株13-13处理组与菌株27-15处理组的根切片病变症状存在明显差异，接种菌株13-13后，第3 d即在离体组织表面观察到大量白色、细密的菌丝，第7 d菌丝体直径继续增大，颜色转变为粉红色;接种菌株27-15后，第3 d离体组织表面出现少量发黑腐烂的病斑和菌丝体，第7 d整个组织块变软，腐烂发黑，发出腐烂的气味。

2. 3. 2 活体组织致病性测定 将代表性菌株的孢子悬浮液分别接种至健康山豆根植株根际，结果（图3）显示，不同遗传背景的菌株间致病性差异明显。分别接种菌株30-8和菌株26-7孢子悬浮液后植株生长正常，连续观察12 d均未出现根腐病症状。分别接种菌株13-13和菌株27-15孢子悬浮液后植株均出现典型的根腐病症状，且病情发展速度和症状相似，具体表现为：接种后第3 d，部分植株开始出现叶片枯黄症状;第3～7 d，植株叶片枯黄比例逐步增加;第7 d，枝叶出现枯黄症状;第10～12 d后，叶片掉落，植株地上部逐渐枯萎甚至全部枯死。

为定性分析尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌对山豆根的致病性及差异，统计分析了山豆根接种2种病原菌后的发病率和病情指数。与无菌水对照组相比，山豆根植株接种尖孢镰刀菌13-13或茄腐镰刀菌27-15后均出现发病症状，且病情恶化速度极快，接种第12 d时发病率和病情指数均分别达100.0%和100.0;植株接种菌株13-13或菌株27-15后病情的发展存在明显差异，接种后第6 d，菌株27-15处理组发病率和病情指数均显著高于菌株13-13处理组（表2）。

2. 4 病原菌的培养特性及形态特征

将菌株13-13和菌株27-15转接至新的PDA培养基上，观察发现，2株菌株生长均较迅速，菌株27-15培养第3 d能明显观察到细密的菌丝，菌丝结合紧密，紧贴于培养基不蓬松，粉红色，培养10 d左右即可铺满培养基（图4-C）;菌株13-13培养第2 d即能明显观察到培养皿上有白色薄絮状菌丝，菌丝蓬松，后期转为淡粉色，培养7 d左右可铺满培养基（图4-A）。

在光学显微镜下观察2株病原菌菌株的显微结构，发现菌株13-13产孢透明，孢子形态有差异，为卵形、肾形和圆形，大小为3.1～23.1 μm×1.5～7.7 μm，平均为13.1 ?m×4.6 ?m（图4-B）;菌株27-15的孢子有大型分生和小型分生2种孢子之分，孢子不透明，小型分生孢子与大型分生孢子数量几近相等，小型分生孢子梭形，大型分生孢子呈镰刀形，细长，孢子大小为3.1～61.5 μm×1.5～5.1 μm，平均为32.3 μm×3.3 μm（图4-D）。

2. 5 病原菌遗传进化分析结果

用ITS1和ITS4引物对分别对菌株13-13和菌株27-15进行rDNA-ITS序列扩增，经测序后获得的序列长度分别为475和514 bp。将拼接的2段序列依次输入NCBI进行BLAST同源性比对，结果显示分别与尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌的同源性为99%。根據BLAST比对结果，选取同源性较高的菌株序列，基于真菌rDNA-ITS序列构建系统发育进化树，结果（图5）表明，菌株13-13和菌株27-15分别与菌株F. oxysporum strain CB54和F. solain isolate ZB11263610的遗传距离最近，聚为一类。向GenBank提交菌株13-13和菌株27-15对应序列，分别得到登陆号SUB10331849和SUB10331864。综合形态和分子鉴定结果，确定菌株13-13为尖孢镰刀菌，菌株27-15为茄腐镰刀菌。

3 讨论

本课题组调查发现，由于单一品种多年连作，同时贵州省地处我国西南山区，常年湿润多雨，山豆根根腐病发病率和致死率均逐年升高，近年来发病率和致死率已分别高达15%～40%和10%。山豆根的入药部位为根部，发生根腐病后，山豆根的产量和品质均受到严重影响，给当地中药材产业带来严重的经济损失。根腐病根据致病物的差异主要可分为细菌性根腐病和真菌性根腐病（Misk and Franco，2011;高芬等，2015;Zhang et al.，2016）。本研究在采集病株时发现，与健康山豆根根系相比，染病山豆根根部表面分布有细密的菌丝，暗示贵州省山豆根根腐病可能主要由病原真菌引起。通过保湿培养法和组织分离法，从山豆根发病组织中共分离获得200株真菌，结合分子生物学和形态学鉴定及回接试验验证，最终确定贵州山豆根根腐病由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌混合侵染引起。覃柳燕等（2010）采用常规组织分离法从广西发生根腐病典型症状的山豆根根部分离出的病原菌为茄腐镰刀菌。本研究结果与其相似，明确茄腐镰刀菌是引起山豆根根腐病的主要致病菌之一;同时，本研究首次证实尖孢镰刀菌也是引起山豆根根腐病的主要病因之一。

尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌均属镰刀菌属，寄主范围和地理分布广泛，能侵染多种中药材、农作物及观赏植物，如黄芪（邓成贵，2005）、芦荟（姬广海等，2007）、小麦（李伟等，2011）、白及（孙乐乐等2013）、甘草（曹雪梅等，2014）、百合（边小荣等，2016）、鹰嘴豆（Zaim et al.，2018）、西瓜（束秀玉，2020）和烟草（姚健等，2020）等，引起植物根腐病或枯萎病。这2种病原菌的菌丝体或厚垣孢子能借助土壤、栽培基质及植物残体过冬，当外界环境适宜时，再通过植株根际和茎基部或其他伤口入侵为害（Chen et al.，2017;Yu et al.，2017）。山豆根在生长发育过程中，由于次生根系分化和发育，导致伤口出现，进而造成病原物入侵，引发如根腐病等根、茎基部病害。本研究结果表明，在山豆根离体组织和活体植株上，尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌均可独立或协同引起根腐病症状。进一步研究发现，无论是室内活体试验还是温室盆栽试验，茄腐镰刀菌的致病力均明显高于尖孢镰刀菌，其中，室内活体试验中茄腐镰刀菌侵染组织横切面的症状与田间病株患病茎基部切面完全一致，呈黑色，根部软，轻捏容易变形，而尖孢镰刀菌接种后主要表现为长出茂密的菌丝，根部轻捏不变形，背对接种的菌面呈健康的淡黄色;盆栽试验中，2种病原真菌均可致病，症状相似，但茄腐镰刀菌处理组根腐病发病速度明显快于尖孢镰刀菌处理组。综合以上试验结果，田间条件下贵州山豆根根腐病虽然由2种病原菌复合侵染引起，但相关症状主要由茄腐镰刀菌引发，可能与茄腐镰刀菌的侵染速度和致病性高于尖孢镰刀菌有关。Wang等（2021）研究表明，2种以上不同种镰刀菌混合接种对玉米植株的致病性较单一病原菌接种强、发病率高且潜育期缩短。有关尖孢镰刀菌和茄腐镰刀菌侵染方式的差异、混合接种与单独接种的症状区别及两者的致病机制等均有待进一步探究。

4 结论

通过病原菌的形态特征观察、致病力测定，结合ITS序列分析，明确贵州山豆根根腐病主要由尖孢镰刀菌和茄腐镰刀复合侵染引起。研究结果丰富了山豆根根腐病致病真菌种类，也为贵州山豆根根腐病病害的综合防控提供了理论基础。

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（責任编辑 麻小燕）

收稿日期：2021-07-02

基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC1708101）

通讯作者：何朋杰（1988-），https：//orcid.org/0000-0003-4379-9126，博士，主要从事中药材病害生物防治研究工作，E-mail：gzhepj 2006@163.com

第一作者：唐小迪（1997-），https：//orcid.org/0000-0003-4460-6138，研究方向为中药材病害生物防治，E-mail：806920640@qq.com