黄独赤霉素受体基因DbGID1s克隆及生物信息学分析

唐文芳 徐升胜 龙雯虹

摘要：【目的】克隆黃独赤霉素受体（GID1）基因DbGID1s，并对其进行生物学信息分析，为深入探究DbGID1s蛋白在黄独生长发育中的作用机制提供理论参考。【方法】采用RT-PCR技术克隆DbGID1s基因，利用生物信息学软件对其理化性质、结构域、磷酸化位点及系统发育进化进行预测分析。【结果】克隆获得4个DbGID1s基因序列，命名为DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C，GenBank登录号为MT648372、MT648374、MT648375和MT648373，长度分别为862、1273、1081和1164 bp，编码292、340、289和360个氨基酸残基。4个DbGID1s蛋白的分子量为32079.17～40301.83 Da，理论等电点（pI）为6.05～8.62，为不稳定的外在膜亲水性蛋白，不存在信号肽序列，其磷酸化位点主要以丝氨酸（Ser，S）为主，且4个蛋白的磷酸位点均有重合位点和突变位点，不仅具有α/β折叠水解酶超级家族羧酸脂肪酶水解活性区域，还具有激素脂肪酶（HSL）的保守结构域（HGG和GXSXG）和催化联合位点（S、D和H）。DbGID1s蛋白与其他植物GID1蛋白序列具有较高的氨基酸序列相似性，其中与山药的相似性达90%以上。【结论】DbGID1s基因具有多种植物GID1 基因的基本特征，其编码的蛋白具有GID1蛋白典型的结构域，其可能参与赤霉素（GA）信号转导，调节黄独的生长发育。

关键词： 黄独;赤霉素受体（GID1）;基因克隆;生物信息学分析

中图分类号： S567.239                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2053-08

Cloning and bioinformatics analysis of gibberellin insensitive dwarf1 gene DbGID1s in  Dioscorea bulbiferas

TANG Wen-fang， XU Sheng-sheng， LONG Wen-hong*

（College of Landscape and Horticulture，Yunnan Agricultural University，Kunming  650201，China）

Abstract：【Objective】The aim of this study was to clone gibberellin insensitive dwarf1（GID1） gene DbGID1s in Dio-scorea bulbifera，conduct bioinformatics analysis，and to provide a theoretical reference for further exploring the mechanism of DbGID1s protein in the growth and development of D. bulbifera. 【Method】DbGID1s were cloned by RT-PCR method; the physical and chemical properties， domains， phosphorylation sites and phylogenetic evolution of these genes were pridicted with bioinformatics softwares. 【Result】Four sequences of gene DbGID1A were obtained， namely DbGID1A （GenBank accession number：MT648372），DbGID1B1 （GenBank accession number：MT648374），DbGID1B2（GenBank accession number：MT648375） and DbGID1C （GenBank accession number：MT648373） . The lengths of four nucleic acid sequences were 862，1273，1081 and 1164 bp，respectively，  and encoding 292，340，289 and 360 amino acids residues，respectively. The molecular weights of the four DbGID1s proteins were 32079.17-40301.83 Da， and their theoretical isoelectric points（pI） varied from 6.05 to 8.62. They were unstable，hydrophilic proteins and located on external membrane. No signal peptide was found in the four DbGID1s proteins. Their phosphorylation sites were mainly serine （Ser， S）， and the phosphorylation sites of the four proteins had coincidence sites and mutation sites. The four proteins not only had the hydrolytic activite area of α/β folding hydrolase superfamily carboxylic acid lipase， but also had conserved domains （HGG and GXSXG） and catalytic joint sites（S， D and H） of hormone lipase （HSL）. The similarity of proteins between D. bulbifera and other species was high，and the homology between D. bulbifera and yam was over 90%. 【Conclusion】The DbGID1s gene in D. bulbifera has the basic characteristics of GID1 genes in many plants and the encoded proteins have the typical domain of GID1 protein， so it is possible that DbGID1s genes participate in gibberellin signal transduction and regulate the growth and development of organs of D. bulbifera.

1. 4 生物信息学分析

利用NCBI进行同源比对;对4个基因序列进行多重比对分析;NCBI ORFfinder在线分析4个基因开放阅读框（ORF）编码的氨基酸序列;利用NCBI的CCD（Conserved domain）在线分析4个基因编码蛋白的保守结构域，利用ExPASy的ProtParam在线分析氨基酸序列;运用ProtScale预测蛋白的亲/疏水性;使用TMHMM Serverv 2.0分析蛋白的跨膜区;使用SignalP 4.1对蛋白的信号肽进行预测分析;利用SOPMA和SWISS-MODEL预测分析蛋白的二级结构和三级结构;NetPhos 3.1在线预测蛋白的磷酸化位点;下载与DbGID1s基因序列相似性较高的其他植物基因序列，并对其CDS序列进行多重比对，利用Clustal X和MAGA 7.0构建系统发育进化树（孙伟博等，2018）。

2 结果与分析

2. 1 总RNA提取和cDNA合成结果

由图1-A可知，利用植物总RNA提取试剂盒提取的黄独嫩叶总RNA条带清晰，且完整性较好。利用微量分光光度计测定总RNA样品A260和A280值，计算RNA纯度（A260/A280）平均值为1.98，表明提取的RNA样品可用于后续试验。利用反转录试剂盒合成的cDNA第一链条带较清晰（图1-B），可用于后续试验。

2. 2 DbGID1s基因克隆结果

以cDNA为模板，利用设计的4对引物PCR扩增出4个序列（图2）。经纯化和测序分析，发现4个序列长度分别为862、1273、1081和1164 bp。

2. 3 DbGID1s基因序列分析结果

利用NCBI的BLASTx对扩增出的4个序列进行比对分析，确定4个序列均为DbGID1s基因，其多重比对结果图3所示。4个DbGID1s基因序列间的相似性为48.06%，表明4个基因序列为GID1基因家族的不同成员，分别命名为DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C，GenBank登录号依次为MT648372、MT648374、MT648375和MT648373，分别编码292、340、289和360个氨基酸残基。NCBI的CCD预测结果显示，DbGID1s蛋白属于水解酶超级家族羧酸脂肪酶家族，具有该家族水解活性区域。

2. 4 DbGID1s蛋白的生物信息学分析结果

2. 4. 1 理化性质 由表2可知，4个DbGID1s蛋白的分子量为32079.17～40301.83 Da，理论等电点（pI）为6.05～8.62，负电荷残基（Asp+Glu）总数为30～38，正电荷残基（Arg+Lys）总数为26～38;DbGID1A和DbGID1C蛋白为不稳定的碱性蛋白，DbGID1B1和DbGID1B2蛋白为不稳定的酸性蛋白;DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C总体平均亲水性GRAVY值分别为-0.295、 -0.099、-0.200和-0.209，表明DbGID1s蛋白为亲水性蛋白;DbGID1s蛋白均位于膜外，为外在膜蛋白，且不存在信号肽序列。

2. 4. 2 二、三级结构预测结果 由表3可知，4个DbGID1s蛋白二级结构均具有α-螺旋、β-折叠、延伸链、无规则卷曲，其中均以α-螺旋和无规则卷曲为主要元件。由图4可知，DbGID1A、DbGID1B1和DbGID1C蛋白与建模残基序列（2zsh.1.A）的相似性分别为73.36%（286aa）、64.97%（331aa）和70.55%（347aa），而DbGID1B2蛋白与建模残基序列（3ebl.1.A）的相似性为71.06%（234aa）。DbGID1A蛋白的三级核心结构由8条β-折叠和9个α-螺旋组成，DbGID1B1蛋白的三级核心结构由8条β-折叠和10个α-螺旋组成，DbGID1B2蛋白的三级核心结构由8条β-折叠和7个α-螺旋组成，DbGID1C蛋白的三级核心结构由8条β折叠和11个α-螺旋组成。可见，DbGID1家族的2个建模具有相同的β-折叠。此外，由于2zsh.1.A具有GA3 GID1-DELLA晶体结构，3ebl.1.A具有水稻GID1与GA4复合物的晶体结构，因此，DbGID1A、DbGID1B1和DbGID1C蛋白具有GA3 GID1-DELLA晶体结构，DbGID1B1蛋白具有水稻GID1与GA4复合物的晶体结构。结合基因序列的CCD预测结果和蛋白预测结果可得出4个DbGID1s蛋白属于α/β折叠水解酶超级家族羧酸脂肪酶家族。

2. 4. 3 结構域预测结果 将DbGID1s蛋白与6个物种的同源蛋白进行氨基酸序列多重比对，结果如图5-A所示。DbGID1s蛋白与其他物种GID1蛋白具有较高的氨基酸序列相似性，且其具有保守序列，如激素酶感酯酶（Hormone sensitive lipase，HSL）的HGG和GXSXG活性区域，及HSL家族催化位点的保守氨基酸即丝氨酸（Ser，S）和天冬氨酸（Asp，D），但DbGID1s蛋白的HSL家族催化位点即组氨酸（His，H）被异亮氨酸（Ile，I）取代。

2. 4. 4 磷酸化位点预测结果 将4个DbGID1s蛋白进行多重比较，结果（图5-B）发现其同源性较高。利用NetPhos在线预测DbGID1s蛋白中的丝氨酸（Ser，S）、苏氨酸（Thr，T）和酪氨酸（Tyr，Y）磷酸化位点，结果（图5-B）显示，DbGID1A、DbGID1B1、DbGID1B2和DbGID1C蛋白磷酸化位点分别为23、21、34和31个，其中，丝氨酸位点最多，分别为16、14、22和16个;苏氨酸位点分别为3、4、6和8个;酪氨酸位点分别为4、3、6和7个。可见，DbGID1s蛋白的磷酸化位点主要以丝氨酸为主，且4个蛋白的磷酸位点均有重合位点和突变位点。

2. 4. 5 系统发育进化分析结果 利用最大近似法构建系统发育进化树，结果如图6所示。4个DbGID1s蛋白与山药GID1蛋白的亲缘关系最近，氨基酸序列相似性达90%以上。其中，DbGID1A蛋白与山药DpGID1A蛋白相似性最高，处于同一小分支，与其他的GID1蛋白（除小立碗藓GID1以外）并列;其余3个DbGID1s蛋白与山药GID1B1均处于同一个分支，其中，DbGID1B1与山药GID1B1的氨基酸序列相似性最高。推测DbGID1A基因与另外3个基因的分化可能早于双子叶植物与单子叶植物的分化。

3 讨论

内质网特异性信号肽具有促进植物膜蛋白表达的作用（Boehm et al.，2000）。本研究生物信息学分析结果显示，DbGID1s不存在信号肽序列和跨膜结构域，说明DbGID1s为非分泌性蛋白，可直接在细胞内发挥作用;DbGID1s蛋白不仅不稳定，而且不耐热，其表达、纯化及保存应在低温下进行;DbGID1s为亲水蛋白，较易溶于水溶液，可依据等电点配置适合的酸碱缓冲液，有利于表达模型的创建及细胞试验等方面的应用。此外，磷酸化是蛋白质翻译后修饰之一，可有效调控蛋白活力和功能，并在细胞信号转导过程中起重要作用。蛋白的磷酸化位点（S、T、Y）在GA信号传导中发挥非常重要作用，分析磷酸化位点的变异规律有助于在合理归类的基础上探究蛋白质翻译后修饰调控的机制（梁前进等，2012）。本研究通过磷酸化位点预测发现DbGID1s蛋白的氨基酸序列含有多个磷酸化位点，为研究GA在黄独体内的信号转导提供理论依据。

据前人研究报道，GID1蛋白是一类含HGG和GXSXG保守结构域的激素敏感脂肪酶受体，在植物生长发育过程中起重要调控作用（Shimada et al.，2008;Sun，2010）。HSL蛋白具有特殊的活性结构域（HGG和GXSXG），不仅维持蛋白功能，还维持GA的稳态并调节GA与其他植物激素之间的相互作用（Aleman et al.，2008）;HSL家族蛋白还具有3种保守氨基酸（S、D和H）的催化联合位点，其对蛋白功能至关重要（Ueguchi-Tanaka et al.，2005）。由于GID1蛋白具有HSL蛋白的保守结构域和催化联合位点，故GID1蛋白具有HSL蛋白的生物学功能，可维持GA稳态，并调节GA与其他植物激素之间的相互作用（Ileperuma et al.，2007）。DbGID1s蛋白属于α/β折叠水解酶超级家族，与HSL家族蛋白结构相似，推测DbGID1s蛋白具有HSL蛋白的功能。宋松泉等（2020）研究发现，拟南芥GID1a具有调控种子休眠的功能，且在种子萌发过程中，GA的信号转导有可能受GA受体基因类型决定。本研究发现，DbGID1s蛋白的结构域与拟南芥GID1a的結构域较一致（图5），故推测DbGID1s蛋白具有调控黄独组织休眠的功能;DbGID1s蛋白存在2种三级结构建模（图3），故推测黄独块茎组织萌发中可能存在2种GA信号转导途径。今后应深入探究DbGID1s蛋白在2种GA信号转导途径的作用机制，并深入解析块茎组织休眠和萌发机制。

参考文献：

白文钦，胡明瑜，潘晓雪，蒋晓英，吴红，雷开荣，罗明. 2019. 玉米赤霉素受体基因ZmGID1a的克隆及功能研究[J]. 安徽农业大学学报，46（1）：133-140. [Bai W Q，Hu M Y，Pan X X，Jiang X Y，Wu H，Lei K R，Luo M. 2019. Clo-ning and functional study of ZmGID1a gene in maize[J]. Journal of Anhui Agricultural University，46（1）：133-140.] doi：10.13610/j.cnki. 1672-352x.20190314.008.

曹天天. 2015. 赤霉素信号转导相关基因OsGID1调控水稻对褐飞虱抗性[D]. 杭州：浙江大学. [Cao T T. 2015. A gibberellin signaling-related gene OsGID1 regulates rice resistance to the brown plantthohopper Nilaparvata lugens[D]. Hangzhou：Zhejiang University.]

高秀华，傅向东. 2018. 赤霉素信号转导及其调控植物生长发育的研究进展[J]. 生物技术通报，34（7）：1-13. [Gao X H，Fu X D. 2018. Research progress for the gibberellin signaling and action on plant growth and development[J]. Biotechnology Bulletin，34（7）：1-13.] doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2018-0447.

梁前进，王鹏程，白燕荣. 2012. 蛋白质磷酸化修饰研究进展[J]. 科技导报，30（31）：73-79. [Liang Q J，Wang P C，Bai Y R. 2012. Summarization on the progress in protein phosphorylation[J]. Science & Technology Review，30（31）：73-79.] doi：10.3981/j.issn.1000-7857.2012.31.011.

龙雯虹，孟金贵，徐升胜，张雪梅，段延碧，杨荣萍. 2019. 山药赤霉素受体基因DoGID1A的克隆及表达分析[J]. 农业生物技术学报，27（11）：1933-1941. [Long W H，Meng J G，Xu S S，Zhang X M，Duan Y B，Yang R P. 2019. Cloning and expression analysis of gibberellin receptor gene DoGID1A in Dioscorea opposita[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，27（11）：933-1941.] doi：10.3969/j.issn. 1674-7968.2019.11.004.

齐蒙，李国瑞，黄凤兰，程永胜. 2017. 赤霉素的代谢途径及其受体GID1的功能研究进展[J]. 种子科技，35（4）：122-123. [Qi M，Li G R，Huang F L，Cheng Y S. 2017. Research progress on the metabolic pathway of gibberellin and the function of its receptor GID1[J]. Seed Science & Technology，35（4）：122-123.] doi：10.3969/j.issn.1005-2690.2017.04.087.

宋松泉，劉军，黄荟，伍贤进，徐恒恒，张琪，李秀梅，梁娟. 2020. 赤霉素代谢与信号转导及其调控种子萌发与休眠的分子机制[J]. 中国科学：生命科学，50（6）：599-615. [Song S Q，Liu J，Huang H，Wu X J，Xu H H，Zhang Q，Li X M，Liang J. 2020. Gibberellin metabolism and signaling and its molecular mechanism in regulating seed germination and dormancy[J]. Scientia Sinica（Vitae），50（6）：599-615.] doi：10.1360/SSV-2019-0289.

孙伟博，马晓星，诸葛强. 2018. 杨树TLP基因家族的生物信息学分析[J]. 南方农业学报，49（7）：1265-1272. [Sun W B，Ma X X，Zhuge Q. 2018. Bioinformatics analysis of TLP gene family in poplar[J]. Journal of Southern Agriculture，49（7）：1265-1272.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191. 2018.07.02.

叶华谷. 2016. 中国药用植物[M]. 北京：化学工业出版社.[Ye H G. 2016. Chinese medicinal plants[M]. Beijing：Chemical Industry Press.]

袁媛，黄璐琦，崔光红，毛莹，何希荣. 2008. 赤霉素及其合成抑制剂对丹参酮类活性物质含量的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，14（6）：1-3. [Yuan Y，Huang L Q，Cui G H，Mao Y，He X R. 2008. Effect of gibberellins and its synthesis inhibitor on metabolism of tanshinones[J]. Chinese Joumal of Experimental Traditional Medical Formulae，14（6）：1-3.] doi：10.13422/j.cnki.syfjx. 2008.06.003.

岳川，曾建明，曹红利，郝心愿，章志芳，王新超，杨亚军. 2013. 茶树赤霉素受体基因CsGID1a的克隆与表达分析[J]. 作物学报，39（4）：599-608. [Yuan C，Zeng J M，Cao H L，Hao X Y，Zhang Z F，Wang X C，Yang Y J. 2013. Cloning and expression analysis of gibberellin receptor gene CsGID1a in tea tree（Camellia sinensis）[J]. Acta Agronomica Sinica，39（4）：599-608.] doi：10.3724/SP.J.1006. 2013.00599.

Aleman L，Kitamura J，Abdel-mageed H，Lee J，Sun Y，Nakajima M，Ueguchi-Tanaka M，Matsuoka M，Allen R D. 2008. Functional analysis of cotton orthologs of GA signal transduction factors GID1 and SLR1[J]. Plant Mole-cular Biology，68（1-2）：1-16. doi：10.1007/s11103-008-9347-z.

Boehm R，Sommer S，Severin K，Li S M，Heide L. 2000. Active expression of the ubiA gene from E. coli in tobacco：Influence of plant ER-specific signal peptides on the expression of a membrane-bound prenyltransferase in plant cells[J]. Transgenic Research，9（6）：477-486. doi：10.1023/ A：1026507803067.

Hirano K，Kouketu E，Katoh H，Aya K，Ueguchi-Tanaka M，Matsuoka M. 2012. The suppressive function of the rice della protein slr1 is dependent on its transcriptional activation activity[J]. The Plant Journal，71（3），443-453. doi： 10.1111/j.1365-313X.2012.05000.x.

Hirano K，Nakajima M，Asano K，Nishiyama T，Sakakibara H，Kojima M，Katoh E，Xiang H Y，Tanahashi T，Hasebe M. 2007. The GID1-mediated gibberellin perception mechanism is conserved in the lycophyte Selaginella moellendorffii but not in the bryophyte physcomitrella patens[J]. The Plant Cell，19（10）：3058-3079. doi：10.1105/TPC.107. 051524.

Hirano K，Ueguchi-Tanaka M，Matsuoka M. 2008. GID1-mediated gibberellin signaling in plants[J]. Trends in Plant Science，13（4）：192-199. doi：10.1016/j.tplants.2008.02. 005.

Ileperuma N R，Marshall S D G，Squire C J，Baker H M，Oakeshott J G，Russel R J L，Plummer K M，Newcomb R D，Baker E N. 2007. High-resolution crystal structure of plant carboxylesterase AeCXE1，from Actinidia eriantha，and its complex with a high-affinity inhibitor paraoxon[J]. Biochemistry，46（7）：1851-1859. doi：10.1021/bi062046w.

Nemoto K，Ramadan A，Arimura G I，Imai K，Tomii K，Shinozaki K，Sawasaki T. 2017. Tyrosine phosphorylation of the GARU E3 ubiquitin ligase promotes gibberellin signalling by preventing GID1 degradation[J]. Nature Communications，8（1）：1-15. doi：10.1038 /s41467-017-01005-5.

Olszewski N，Sun T P，Gubler F. 2002. Gibberellin signaling：Biosynthesis，catabolism，and response pathways[J]. The Plant Cell，14：61-80. doi：10.1105/TPC.010476.

Shimada A，Ueguchi-Tanaka M，Nakatsu T，Nakajima M，Naoe Y，Ohmiya H，Kato H，Matsuoka M. 2008. Struc-tural basis for gibberellin recognition by its receptor GID1[J]. Nature，456（7221）：520-523. doi：10.1038/nature07 546.

Sun T P. 2010. Gibberellin-GID1-DELLA：A pivotal regulatory module for plant growth and development[J]. Plant Phy-siology，154（2）：567-570.

Ueguchi-Tanaka M，Ashikari M，Nakajima M，Itoh H，Katoh E，Kobayashi M，Hsing Y I，Yamaguchi I，Matsuoka M. 2005. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin[J]. Nature，437（7059）：693-698. doi：10.1038/nature04028.

Ueguchi-Tanaka M，Nakajima M，Katoh E，Ohmiya H，Matsuoka M. 2007. Molecular interactions of a soluble gibberellin receptor，GID1，with a rice DELLA protein，SLR1，and gibberellin[J]. The Plant cell，19（7）：2140-2155. doi： 10.1105/TPC.106.043729.

Yoshida H，Tanimoto E，Hirai T，Miyanoiri Y，Mitani R，Kawamura M，Takeda M，Takehara S，Hirano K，Kainosho M，Akagi T，Matsuoka M，Ueguchi-Tanaka M. 2018. Evolution and diversification of the plant gibberellin receptor GID1[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，115（33）：E7844-E7853. doi：10.1073/pnas.1806040115.

（責任编辑 陈 燕）

收稿日期：2020-08-13

基金项目：国家自然科学基金项目（31460322）

通讯作者：龙雯虹（1972-），https：//orcid.org/0000-0001-6919-6038，博士，副教授，主要从事蔬菜育种、资源评价与利用研究工作，E-mail：lwh57@sina.com

第一作者：唐文芳（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-8752-2324，研究方向为蔬菜资源评价与利用，E-mail：T2676630889@126.com