有丝分裂相关蛋白TPX2、Aurora-A、FBXW7在食管癌发生机制中的作用及预后研究

何琳莉，黄一凡

(川北医学院，1.病理学教研室；2.附属医院病理科，四川 南充 637000)

食管癌是一种临床中非常多见的恶性肿瘤疾病，发病率和死亡率分别居全部恶性肿瘤疾病中的第八位和第六位[1-2]。目前，在食管癌高发地区的普查中仍以内窥镜检查和食管拉网脱落细胞检查为主，但筛查效率较低，局限性较大。因此，探讨食管癌的发病机制，寻找和发现早期诊断生物标志物至关重要。与大多数肿瘤一样，食管癌是一种多基因参与、多因素作用、多阶段发展的复杂性疾病，其发病机制仍然无法完全明确[3]。有研究者[4]认为，有丝分裂相关蛋白在肿瘤中扮演着重要角色。目前，针对有丝分裂相关蛋白在肿瘤中的作用成为肿瘤研究的重要思路和热点。本研究通过测定有丝分裂相关蛋白Xklp2靶蛋白(TPX2)、极光激酶A(Aurora-A)、F框/WD40蛋白基因(FBXW7)在食道癌的表达情况，探讨三者之间及与肿瘤组织病理特征、五年生存率的相关性，为临床诊治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2012年1月至2013年12月川北医学院附属医院127例食管癌患者存档的癌组织及癌旁组织石蜡标本，分别设为癌组织组和癌旁组织组；另选60例食管高级别上皮内瘤变组织标本为对照组。所有病例均未接受过任何临床治疗或者辅助治疗，有完整的临床资料；标本均经10%中性甲醛固定处理，常规包埋、切片，切片规格均采取连续切取4 μm的组织切片，备用，并由病理科医师重新阅片复核。

1.2 方法

1.2.1 TPX2、Aurora-A、FBXW7水平检测 运用免疫组化法(IHC)染色，EnVision System二步法显色法检测，具体操作如下：脱蜡、水化组织切片；预处理组织切片；蒸馏水漂洗，放置于TBS内；阻断内源性氧化物酶；蒸馏水漂洗，置TBS 10 min；一抗孵育10～30 min；TBS漂洗10 min；EnVision TM孵育10～30 min；TBS漂洗10 min；色源底物溶液孵育10 min；蒸馏水漂洗；复染及封片，光镜观察。运用已知阳性切片作为阳性对照；PBS代替一抗作为阴性对照组。一抗抗体(TPX2货号：TA328025；Aurora-A 货号：TA346888；FBXW7货号：TA802834)与二抗试剂盒(货号：SAP-9101)均购自北京中衫金桥生物有限公司，操作均严格按照说明书要求进行。

1.2.2 结果判断 TPX2及FBXW7蛋白的阳性信号定位在细胞核内，表现为棕黄色或黄色。Aurora-A蛋白的阳性信号定位在细胞浆内，呈黄色颗粒或者棕黄色颗粒。由两名有丰富经验的病理科医师同时进行双盲阅片，每张切片随机计数均在10个高倍镜下(×400)视野中表现为阳性细胞，即可判断[5]：棕褐色为3分，棕黄色为2分，淡黄色为1分，无着色为0分；阳性范围>75%为4分，51%～75%为3分，26%～50%为2分，5%～25%为1分，<5%为0分；上述两项分数总分，作为最终判断结果；4～7分为强阳性(++)，2～3分为弱阳性(+)，<2分为阴性(1)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同组织TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白表达阳性率比较

癌组织组TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白阳性率高于癌旁组织组和对照组(P<0.05)，且对照组高于癌旁组织组(P<0.05)。见图1、图2、图3及表1。

表1 不同组织TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白阳性表达率比较[n(%)]

2.2 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白与食管癌临床病理特征的关系

不同食管癌淋巴结转移的TPX2蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同肿块浸润深度、食管癌淋巴结转移的Aurora-A蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.05)；不同临床病理特征食管癌的FBXW7蛋白表达比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白与食管癌临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白表达的相关性

相关性分析显示，Aurora-A与TPX2的表达呈正相关(r=5.581，P<0.05)；Aurora-A与FBXW7的表达呈负相关(r=-3.514，P<0.05)；TPX2与FBXW7的表达无明显相关性(r=0.362，P>0.05)。见表3、表4及表5。

表3 TPX2与Aurora-A蛋白表达的相关性[n(%)]

表4 TPX2与FBXW7蛋白表达的相关性[n(%)]

表5 Aurora-A与FBXW7蛋白表达的相关性[n(%)]

2.4 TPX2、Aurora-A、FBXW7蛋白表达与食管癌患者5年生存率的相关性

患者5年随访平均生存时间为2.32年，其中TPX2、Aurora-A、FBXW7阴性表达51例患者平均生存时间为3.63年，生存率为68.63%(35/51)；TPX2、Aurora-A、FBXW7阳性表达58例患者平均生存时间为1.01年，生存率为18.97%(11/58)。生存率分析结果显示，TPX2与食管癌患者5年生存率相关(P=0.026)，Aurora-A与FBXW7与患者预后无明显相关性(P=0.639、0.727)。见图4。

3 讨论

肿瘤通常是在机体各种不同致癌成分共同作用下，组织中某个细胞的基因水平出现异常调控而发生克隆性的非正常增生导致的异常病变现象[6]。有丝分裂相关蛋白可参与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡以及周期分布等生物学功能的调控[7]。Samson等[8]首次明确了有丝分裂相关蛋白与肿瘤的发生发展有着密切关系。随后关于有丝分裂相关蛋白参与肿瘤疾病生物学功能的相关研究成果也随之逐渐明确。

研究[9]成果表明，在宫颈癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤疾病中，TPX2呈现为呈现明显的高表达，且阳性表达率为70%～95%。本研究结果显示，TPX2阳性率在癌旁组织、食管高级别上皮内瘤变和癌组织的表达率依次增高(P<0.05)，阳性表达率为59.84%(76/127)，可能与病例选择的差异有关。相关性及生存分析发现，TPX2蛋白表达水平与食管癌的淋巴结转移密切相关(P<0.05)，且与食管癌患者5年生存率相关(P<0.05)。TPX2是有丝分裂过程中的一种核增生性相关蛋白，表达受严格的控制。Liu等[10]研究认为，TPX2的刺激能够促使T-Loop中较为保守的T288在有丝分裂双极纺锤体柱组装期间发挥磷酸化作用，从而促使Aurora-A被迅速的激活。另有研究[11]证实，在有丝分裂过程中，TPX2既参与了微管的形成及中心体酶的活化，还可对Aurora-A进行调节，使其能够与其他蛋白形成相互作用，表明在食管癌的发生发展过程中，TPX2在淋巴结转中可能参与了众多基因表达，并且发挥了非常很重要的协同作用，并且在预后判断上具有较高的应用价值。

本研究中，Aurora-A阳性表达率为48.82%(62/127)，低于已有研究，可能与病例选择、标本处理方法和操作方法的差异有关。相关性分析显示， Aurora-A蛋白表达水平与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)，表明在组织病变过程中，Aurora-A发挥部分作用。生存分析发现，Aurora-A与患者5年生存率无相关性(P>0.05)，表明Aurora-A在食管癌预后诊断中价值不高。Aurora-A是一种具有较高保守度的C末尾催化结构域，主要的功能是在启动子的参与下，实现中心体的分离、复制，是DNA正常复制至关重要的调节器[12]。既往研究[13]也发现，在卵巢癌、卵巢正常组织的细胞质中均能检测到Aurora-A蛋白表达，尤其在卵巢癌中呈现为非常显著的高表达。

有研究[14]表明，在子宫颈癌、胃癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤疾病中，FBXW7均呈现低表达，阳性表达率为20%～35%。本研究结果显示，癌组织中FBXW7阳性率高于食管高级别上皮内瘤变和癌旁组织(P<0.05)，与上述结论一致，表明随着疾病的恶化，FBXW7蛋白的抑制作用也越来越明显；而FBXW7的阳性表达率(45.67%)高于上述研究结果，可能也与病例选择的差异有关。FBXW7是F-box蛋白中非常重要的家族成员，能够实现对原癌基因表达蛋白产物的快速降解，以此来实现对肿瘤的有效抑制[15]。相关性分析发现，FBXW7蛋白与各项病理特征均无相关性(P>0.05)，推测可能是在食管癌的发生发展期间，FBXW7并非呈现为绝对的阳性表达，仅是在其中发挥着一部分的作用。FBXW7与食管癌患者5年生存率也无明显相关性(P>0.05)，进一步证实了FBXW7的协作作用。

综上所述，在食管癌的发生发展过程中，有丝分裂相关蛋白TPX2、Aurora-A、FBXW7均有参与，其中TPX2的参与作用更大，Aurora-A、FBXW7更多的是协同作用，故在预后诊断中，TPX2具有较高价值。