CCT亚基γ在鼻咽癌组织中的表达及临床意义

李刚，高天生，黎骋，李冬梅，梁伟，黄卓

(梧州市红十字会医院，1.肿瘤科，2.病理科，3.院感科，广西 梧州 543002)

鼻咽癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，好发于鼻咽黏膜处。现阶段治疗手段较之前已取得较大的进步，然而仍有部分患者治疗后存在复发和转移风险，预后并不理想[1]。随着现代分子生物学的不断发展，基因的检测及靶向诊治已成为现代学者研究的焦点[2-3]。伴侣蛋白携带t复合多肽1(chaperones carry T complex polypeptide 1，CCT)作为分子伴侣素，在哺乳动物中由7～9种不同的亚基组成，且每个亚基的病理生理作用存在一定差异[4]。有研究[5]报道，CCT亚基γ与恶性肿瘤患者肿瘤细胞分化程度相关。但目前国内外尚未见有CCT亚基γ和人鼻咽癌关系的研究报道。本研究首次通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫组化及免疫印迹法检测人鼻咽癌组织及鼻咽粘膜慢性炎组织中CCT亚基γ表达情况，初步探讨CCT亚基γ与鼻咽癌患者临床病理特征的关系及对预后的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象 选择2012年5月至2017年6月梧州市红十字会医院随访资料完整的的活检术标本，所有标本均经过病理试验证实，包括100例鼻咽癌患者的癌组织(鼻咽癌组)和60例鼻咽黏膜慢性炎患者的炎症组织(鼻咽黏膜慢性炎组)。鼻咽癌组中，男性72例，女性28例；年龄19～76岁，平均(45.10±9.12)岁。鼻咽黏膜慢性炎组中，男性46例，女性14例；年龄17～78岁，平均(45.52±8.06)岁。本研究经院医学伦理委员会批准，研究对象均已签署知情同意书。鼻咽癌纳入标准：(1)所有鼻咽癌患者均经过病理活检诊断证实，并符合鼻咽癌诊断标准[6]；(2)均为初发鼻咽癌患者；(3)在本次确诊前未接受过放化疗等抗肿瘤手段。排除标准：(1)临床资料不齐全；(2)精神异常或认知功能障碍者；(3)患其他恶性肿瘤者；(4)患有严重感染性及内科疾(心肝肾肺脑等)病者。

1.1.2 主要仪器与试剂 PrimeScript RT(货号：RR037A)和SYBR®Premix Ex TaqTM II试剂盒(货号：RR820A)均购自宝生物工程(大连)有限公司；CCT亚基γ(货号：7203)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(货号：113444562)引物交由上海生工生物工程有限公司，使用primer premier5.0软件设计；蛋白提取试剂盒(货号：R0050)及紫外分光光度计(型号：UV-1500)均购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗人CCT亚基γ抗体(货号：10571-1-AP)和兔抗人GAPDH抗体(货号：10494-1-AP)购自Proteintech公司，山羊抗兔二抗(货号： A21020)购自艾美捷科技有限公司；BCA试剂盒(货号：23227)购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR，RT-qPCR)检测 通过TRlzol法提取各组织标本中总RNA，具体操作如下：取咽癌组织和鼻咽黏膜慢性炎组织50～100 mg，加入1 mL的TRlzol，对组织剪碎及匀浆，再加入氯仿，高速离心分离后，将上层(含有RNA的无色水样层)移至新的EP管中，经0.5 mL异丙醇处理，高速离心分离，弃上清，加入75%乙醇1 mL处理，高速离心分离，弃上清，室温晾干，再加入20 μLDEPC水溶解，促溶后-80℃保存待用。利用Nanodrop法对RNA浓度、纯度进行定量，将RNA逆转录合成cDNA：逆转录体系为10 μL，反应条件设置为：37 ℃，15 min×3次，85 ℃ 条件下5 s。CCT亚基γ(扩增片段大小117 bp)上游引物序列：5’-GCAAGTGTGCCGCAATGTTCTACT-3’；下游引物序列：5’-TGTTCCACACCAGTCATGGCCTTA-3’。GAPDH(扩增片段大小115 bp)上游引物序列：5’-TCAACAGCAACTCCCACTCTTCCA-3’；下游引物序列：5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3’。实施荧光定量PCR操作，总反应体系为20 μL：SYBR Green Premix10 μL，上游和下游引物各1 μL，2 μL模板，6 μL去离子水。CCT亚基γ反应条件设定为：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环。利用2-ΔΔCt法计算CCT亚基γ的相对表达水平。

1.2.2 免疫印迹检测 将各组织标本剪碎并在匀浆器中进行匀浆，加入裂解液于匀浆中进行匀浆，置于冰上，重复几次后使组织尽量碾碎，裂解0.5 h后将裂解液转移至离心管中，离心分离组织总蛋白。定量上清液蛋白，加上样缓冲液，沸水浴10 min，予以10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转PVDF膜，5%脱脂牛奶密封2 h，添加CCT亚基γ一抗(稀释1∶500)、GAPDH (稀释1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，冲洗后，将相应二抗(稀释1∶5 000)与PVDF膜室温下孵育1 h。ECL暗室曝光显影，利用图像扫描采集图片数据(蛋白条带灰度值)，蛋白相对表达量=灰度值/GAPDH条带灰度值。

1.2.3 免疫组化检测 将各组织标本于10%的甲醛中固定，进行切片脱蜡和复水，将切片放置于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，沸水浴20 min进行抗原修复，将抗原修复的石蜡切片冷却至室温，通过双蒸水浸泡10 min后，吸去切片表面双蒸水，在10%山羊血清中室温孵育30 min。吸去山羊血清，加CCT亚基γ一抗(稀释1∶50)，4 ℃孵育过夜，吸去一抗，冲洗三遍。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(稀释1∶200)，孵育1 h，冲洗3遍后，显色封片。通过SDX-100倒置显微镜进行摄片，免疫组化染色结果根据染色强度及阳性率进行判断，其中染色强度为颜色从无色逐渐加深至棕褐色，表明染色度越明显，CCT亚基γ阳性表达越明显。CCT亚基γ阳性表达率=CCT亚基γ细胞个数×100%/总细胞，其中0分为阴性；阳性率1%～25%为1分；阳性率26%～50%为2分；阳性率51%～75%为3分；阳性率在76%～100%为4分[7]。

1.2.4 临床病理特征分析 整理全部鼻咽癌患者临床资料，根据CCT亚基γ 蛋白相对表达中位值将鼻咽癌患者分为高低表达组，其中超过CCT亚基γ蛋白相对表达水平中位值的患者纳入高表达组，低于CCT亚基γ蛋白相对表达水平中位值的患者纳入低表达组[8]，并分析CCT亚基γ不同表达水平与鼻咽癌患者年龄、性别、吸烟史、原发肿瘤局部淋巴结远处转移分期(distant lymph node metastases of the primary tumor，TNM分期)、复发、远处转移及病理分型等临床病理资料之间的关系。对2012年至2017年期在本院诊治的鼻咽癌患者，以电话、门诊检查等方式进行随访，每次随访做好记录，以病理确诊日作为观察起点，随防至2021年6月，分析CCT亚基γ不同表达水平对患者生存情况的影响，记录患者的3年总生存率。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 CCT亚基γ mRNA的表达水平

RT-qPCR实验结果显示，鼻咽癌组CCT亚基γ mRNA相对表达水平高于鼻咽黏膜慢性炎组(P<0.05)。见图1。

2.2 各组织标本中CCT亚基γ蛋白表达情况

免疫组化及免疫印迹实验结果显示，鼻咽癌组CCT亚基阳性表达率评分及蛋白水平均高于鼻咽黏膜慢性炎组(P<0.05)，并根据CCT亚基γ蛋白相对表达中位值将鼻咽癌患者分为高表达组和低表达组，每组各50例。见图2。

2.3 CCT亚基γ表达与鼻咽癌患者临床病理资料之间的关系

CCT亚基γ蛋白表达水平与鼻咽癌患者的TNM分期、复发有关(P<0.05)，而与年龄、性别、吸烟史、远处转移及病理分型无关(P>0.05)。见表1。

表1 CCT亚基γ蛋白表达与鼻咽癌患者临床病理资料之间的关系[n(%)]

2.4 CCT亚基γ基因表达水平对乳腺癌患者预后的影响

CCT亚基γ蛋白高表达水平患者3年总生存率为68.00%，低于CCT亚基γ低表达水平患者的92.00%(χ2=3.984，P=0.046)。见图3。

3 讨论

鼻咽癌是发病于鼻咽顶壁及咽隐窝的常见恶性肿瘤，全球发病率及死亡率较高，对放化疗比较敏感，早期患者予以积极治疗，生存预后尚可，而中晚期患者已出现肿瘤细胞局部浸润及远处转移，往往患者预后不佳。因此，有必要探究鼻咽癌的发生发展的机制，寻找有助于鼻咽癌诊治及预后判断的新型肿瘤标志物。

分子伴侣素是一类能特异结合及释放底物蛋白的蛋白分子，在原核细胞、真核细胞和古细菌中均有分布，主要以由8个不同的亚基排成的一个中空柱状体CCT为代表。现代研究多集中于CCT亚基α与肿瘤发展机制的报道[9-10]，而关于CCT亚基γ在鼻咽癌组织中表达及其与患者病理特征和预后关系尚未见报道。近些年来，谭晓虹等[5]研究发现，伴侣素CCT亚基γ在肝癌组织中呈异常高表达水平，且与肝癌患者肿瘤细胞的分化密切相关，表明CCT亚基γ可能参与肿瘤的分子发病机制。

本研究结果显示，鼻咽癌组CCT亚基γmRNA、阳性表达率评分及蛋白水平均高于鼻咽黏膜慢性炎组(P<0.05)，提示鼻咽癌组织中呈高表达水平，推测CCT亚基γ可能参与鼻咽癌的发生发展；其原因可能是有关上游非编码RNA的CCT亚基γ靶基因，在鼻咽癌组织中呈低表达水平，进而靶向上调了鼻咽癌组织中CCT亚基γ表达。肖晶鑑[11]研究报道mir-24在鼻咽癌细胞中呈低表达水平，且已有研究[12]证实，mir-24与CCT亚基γ之间呈靶向负调控关系，进而mir-24低表达通过靶向上调CCT亚基γ水平起到参与癌细胞的增殖、侵袭及迁移。但具体分子生物学作用机制有待进一步深入研究。本研究临床病理特征分析结果显示，CCT亚基γ表达水平与鼻咽癌患者的TNM分期、复发有关(P<0.05)，而与年龄、性别、吸烟史、远处转移及病理分型无关(P<0.05)。TNM分期是反应鼻咽癌原发肿瘤侵犯程度、区域淋巴结转移及是否发生远处转移的重要依据，而TNM分期III～IV期鼻咽癌组织中CCT亚基γ高表达占比较多，说明CCT亚基γ的高表达参与了鼻咽癌肿瘤细胞的增殖、侵袭及迁移，促进鼻咽癌患者病情的发生发展，并增加了患者治疗后的复发风险。有研究[13-15]认为，CCT亚基γ的高表达可能会促进肿瘤细胞的有丝分裂及增殖，进而调控肿瘤的发生发展，对鼻咽癌的发生进展具有促进意义；其次CCT3诱导细胞内ROS和能量代谢中游离氨基酸的失衡来抑制肿瘤细胞凋亡的机制，进而促进肿瘤细胞增殖分化，参与疾病的进展[16]；另外，CCT3基因表达上调与丝裂原活化蛋白激酶激酶7、细胞分裂周期42、细胞周期蛋白D3上调、细胞周期蛋白依赖激酶2、6下调有关，进而对CCT3在肿瘤的发生发展中起着重要作用[17]。而谭晓虹等[5]研究则认为，CCT亚基γ的高表达水平与肿瘤分化程度有关，与肿瘤临床分期、年龄等无关，原因可能与本研究纳入病例不够丰富、疾病种类不同及对每一例患者进行直接上门随访各种原因的限制等原因有关。后期研究值得进一步扩大样本量，以及完善随访效果，以进一步明确CCT亚基γ与鼻咽癌病理发展的关系。

本研究还发现，CCT亚基γ高表达水平患者的3年总生存率为68.00%，低于CCT亚基γ低表达水平患者92.00%(P<0.05)，提示CCT亚基γ高表达水平预示鼻咽癌患者预后不良，原因可能是CCT亚基γ高表达水平促进鼻咽癌的疾病进展，进而缩短了患者的生存时间。同时临床上通过检测鼻咽癌组织中CCT亚基γ水平，有助于患者预后生存情况的评估。因此CCT亚基γ有望成为鼻咽癌临床分期、复发及预后的生物学指标，对术前方案制定、术后辅助治疗及预后评估具有一定的辅助指导价值。

综上，CCT亚基γ在鼻咽癌组织中呈高表达水平，与鼻咽癌患者临床分期及复发密切相关，CCT亚基γ水平的增高预示着患者预后不良。