薯蓣皂苷对硫代乙酰胺诱导急性肝损伤模型大鼠的保护作用

2021-12-15刘伯毅方志成李红新

中国药业 2021年23期

刘潭，夏骏，刘伯毅，方志成，李红新

（湖北省十堰市太和医院·湖北医药学院附属医院，湖北十堰 442000）

急性肝损伤以细胞坏死、炎症和氧化损伤为特征［1］，过量产生促炎因子会诱发炎症，并与肝损伤的发展、恶化、死亡率增加有关。硫代乙酰胺（TAA）是一种经典的肝脏有毒化合物，可诱导氧化应激和炎性反应引起器官损伤，用于建立肝损伤实验模型［2］。法尼酯衍生物X 受体（FXR）是一种高表达肝核胆汁酸受体，在胆固醇／胆汁酸代谢、葡萄糖／脂质代谢、氧化应激和炎性反应中起关键作用［3］。研究表明，FXR 可能是肝病的潜在治疗靶标，FXR 激动剂可抑制胆汁酸引起的氧化应激反应，FXR 配体可能是肝炎性疾病的潜在治疗手段［4－5］。FXR可调节AMP 活化蛋白激酶（AMPK）来保护肝损伤，在氧化应激、炎性反应和线粒体功能障碍中起调节作用［6］。许多用于细胞保护的药物可通过激活AMPK 抑制自由基，并诱导抗氧化酶产生［7］，激活 FXR ／AMPK 信号通路是肝损伤的治疗靶点。薯蓣皂苷是一种具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等功效的天然药物，对四氯化碳引起的急性肝损伤具有保护作用［8］。本研究中探讨了薯蓣皂苷对TAA 诱导的急性肝损伤模型大鼠的保护作用，以及FXR／AMPK 信号通路的作用机制，为薯蓣皂苷开发保肝药物提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：AU5800 型全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）；HBS－1096B 型酶标仪（南京德铁实验设备有限公司）；BIO－RAD 型垂直电泳仪（美国BD 公司）；LYNX4000 型高速冷冰离心机（德国SorvallHeraeus 公司）；AL104 型电子天平（梅特勒＜上海＞仪器有限公司，精度为 0.1mg）；HR2838 型匀浆机（上海菲利普公司）。

试药：薯蓣皂苷对照品（陕西慈缘生物技术有限公司，批号为19057－60－04，纯度为98%）；水飞蓟素（德国马博士大药房，批号为254952）；TAA（美国Sigma 公司，批号为 2020045－1－7）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（批号为080120），天冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（批号为080122），均购于中生北控生物科技有限公司；肿瘤坏死因子－α（TNF －α）试剂盒（批号为MM －0670R84），白细胞介素 6（IL －6）试剂盒（批号为MM －0670R22），白细胞介素 10（IL －10）试剂盒（批号为MM－0670R72），均购于欣博盛生物科技有限公司；谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒（批号为 A004－1－3），超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒（批号为A003－1－4），丙二醛（MDA）检测试剂盒（批号为 A002－2－1），均购于南京建城生物工程有限公司；蛋白抽提试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号为175056）；FXR 抗体（批号为 SC －4176），AMPK 抗体（批号为 SC －5218），核因子 E2 相关因子 2（Nrf2）抗体（批号为 SC －5328），核转录因子 κB 抗体（NF－κB，批号为 SC －5329），β －actin抗体（批号为SC－5429），均购于美国Santa Cruz 公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记亲和纯化山羊抗鼠免疫球蛋白（Ig）G 二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为 115－58－264）；生理盐水。

动物：健康雄性SD 大鼠购自广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号为SYXK（桂）2019－0003，动物质量合格证号为0015182。于温度为（22±2）℃，相对湿度为 40% ～70%，噪音≤50 dB，昼夜循环（12 h ／12 h）的环境中适应性喂养，1 周后进行实验。

1.2 分组、造模及给药

将60 只雄性大鼠均分为正常对照组（A 组），模型组（B 组），薯蓣皂苷低剂量组（C1组）、中剂量组（C2组）、高剂量组（C3组）和阳性对照组（D 组）。C1组、C2组、C3组大鼠分别灌胃薯蓣皂苷 25，50，100 mg ／kg［9］，D 组大鼠灌胃水飞蓟素 200 mg ／kg［10］，A 组和 B 组大鼠灌胃生理盐水每 100 g 体质量 0.1 mL，每天 1 次，连续 7 d。末次灌胃 2 h 后，B 组、C1组、C2组、C3组、D 组大鼠均腹腔注射 TAA 100 mg ／ kg，A 组大鼠腹腔注射等量生理盐水。禁食不禁饮，24 h 后麻醉大鼠，心脏取血3 mL，以3 000 r／min 的速率离心15 min，分离血清；处死大鼠，分离肝脏，液氮保存，备用。

1.3 观察指标

血清中ALT 和AST 水平：采用 AU5800 型自动生化分析仪测定血清中ALT 和AST 的水平。

血清中 TNF－α，IL－6，IL－10 水平：酶联免疫吸附试验（ELISA）法。血清离心，取上清液，将 TNF－α，IL －6，IL －10 一抗稀释至 10 μg／mL，加入 96 孔板中（每孔 0.1 mL），4 ℃过夜，洗涤 3 次，加血清 0.1 mL 于上述反应孔中，37 ℃孵育1 h；加入新配置相应的二抗0.1 mL，孵育 1 h，显色 20 min，用 2 mol／L 硫酸 0.05 mL终止反应，于450 nm 波长处测定各孔吸光度值。

肝组织中 GSH 与 SOD 活性和 MDA 含量：ELISA 法检测。取肝组织，按 1 ∶10（m ∶V）加入生理盐水，制成匀浆，加入磷酸盐缓冲液 1 mL，12 000 r／min 离心 10 min，收集上清液，将相应一抗稀释至10 μg／mL，加入96 孔板中，每孔 0.1 mL，4 ℃ 过夜，洗涤 3 次，加肝组织匀浆0.1 mL 于上述反应孔中，37 ℃孵育 1 h；加入新配置相应的二抗 0.1 mL，孵育 1 h，显色 20 min，用 2 mol／L 硫酸0.05 mL 终止反应，于450 nm 波长处测定各孔吸光度。

肝组织中 FXR，AMPK，Nrf2，NF－κB 蛋白表达水平：蛋白免疫印迹（Western blot）法检测。取肝组织，用磷酸盐缓冲液洗涤2 次，用研钵研碎，加入蛋白抽提试剂，冰浴2h后离心，取上清液，每孔30 μg，电泳，转膜，用5%脱脂牛奶在室温下封膜 1h，将膜与 FXR（1 ∶200）、AMPK（1 ∶400）、Nrf2（1 ∶300）、NF －κB（1 ∶200）、β － actin（1 ∶1 000）进行孵育，4 ℃ 过夜，将山羊抗鼠 IgG 二抗（1 ∶10 000）在室温下孵育30 min。显色，采集图像，采用AlphaEaseFC 图像分析软件分析，以β－actin 作为内对照。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 血清 ALT 和 AST 水平

与 A 组比较，B 组、C1组、C2组、C3组、D 组大鼠血清中 ALT 和 AST 水平均显著升高（P＜ 0.05）；与 B 组比较，C1组、C2组、C3组、D 组大鼠血清中 ALT 和 AST水平均显著降低，且C1组、C2组、C3组呈剂量依赖性（P＜ 0.05）；D 组和 C3组各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表 1。

表1 薯蓣皂苷对TAA 致肝损伤模型大鼠血清中ALT 和AST水平的影响（，U ／L，n ＝ 10）Tab.1 Effect of diosgenin on serum ALT and AST levels in model rats with TAA －induced liver injury（，U ／L，n ＝ 10）

注：与 A 组比较，a P ＜ 0.05；与 B 组比较，b P ＜ 0.05；与 C1 组比较，c P ＜ 0.05；与 C2 组比较，d P ＜ 0.05。表 2 至表 4 同。Note：Compared with those in group A，a P ＜ 0.05；compared with those in group B，bP ＜ 0.05；compared with those in group C1，cP ＜ 0.05；compared with those in group C2，dP ＜ 0.05，as well as Tab.2 to Tab.4.

组别A 组B 组C1 组C2 组C3 组D 组剂量（mg／kg）25 50 100 200 ALT 18.26 ± 83.14 138.07 ± 21.43a 104.52 ± 9.31ab 89.21 ± 10.38abc 65.78 ± 7.13abcd 67.34 ± 8.24abcd AST 47.79 ± 6.30 273.56 ± 17.62a 216.51 ± 27.38ab 162.49 ± 8.92abc 82.37 ± 11.50abcd 79.10 ± 9.54abcd

2.2 血清 TNF －α，IL －6，IL －10 水平

与 A 组比较，B 组、C1组、C2组、C3组、D 组大鼠血清中 TNF －α 和 IL －6 水平均显著升高，IL －10 水平均显著降低（P＜0.05）；与 B 组比较，C1组、C2组、C3组、D 组大鼠血清中 TNF －α 和 IL－6 水平均显著降低，IL－10 水平均显著升高，且C1组、C2组、C3组呈剂量依赖性（P＜ 0.05）；D 组和 C3组大鼠各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表 2。

表2 薯蓣皂苷对TAA 致肝损伤模型大鼠血清中TNF－α，IL －6，IL －10 水平的影响（，pg ／mL，n ＝ 10）Tab.2 Effect of diosgenin on serum TNF－α，IL－6 and IL－10 levels in model rats with TAA－induced liver injury（，pg ／mL，n ＝ 10）

组别A 组B 组C1 组C2 组C3 组D 组剂量（mg／kg）25 50 100 200 TNF－α 475.76 ± 58.61 2 348.28 ±273.16a 1 958.34 ±267.39ab 1 658.29 ± 135.81abc 1 062.24 ±245.17abcd 1 043.25 ± 159.22abcd IL－6 328.14 ± 46.72 1 172.32 ± 104.20a 1 003.59 ± 89.61ab 837.62 ± 57.15abc 643.50 ± 67.64abcd 621.83 ± 74.69abcd IL－10 673.28 ± 79.21 242.62 ± 53.42a 341.28 ± 39.19ab 407.92 ± 67.34abc 573.16 ± 79.58abcd 590.45 ± 47.50abcd

2.3 肝组织 GSH 与 SOD 活性和 MDA 含量

与 A 组比较，B 组、C1组、C2组、C3组、D 组大鼠肝组织中MDA 含量均显著升高，GSH 和SOD 活性均显著降低（P＜ 0.05）；与 B 组比较，C1组、C2组、C3组、D 组大鼠肝组织中MDA 水平均显著降低，GSH 和SOD 活性均显著升高，且 C1组、C2组、C3组呈剂量依赖性（P＜0.05）；D 组和 C3组大鼠各指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 薯蓣皂苷对TAA 致肝损伤模型大鼠肝组织中GSH 与SOD 活性和MDA 含量的影响（，n ＝ 10）Tab.3 Effect of diosgenin on GSH and SOD activities and MDA content in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury（，n ＝ 10）

组别A 组B 组C1 组C2 组C3 组D 组剂量（mg／kg）25 50 100 200 GSH（μmol／mgprot）5.76 ±0.69 3.18 ± 0.41a 3.60 ±0.53ab 4.52 ±0.49abc 5.18 ± 0.61abcd 5.24 ±0.39abcd SOD（U ／mgprot）180.19 ±15.31 102.47 ± 5.48a 127.71 ±10.31ab 139.62 ±15.46abc 160.84 ± 12.73abcd 162.73 ±14.24abcd MDA（nmol／mgprot 3.28 ±0.41 5.69 ± 0.80a 4.68 ±0.34ab 4.22 ±0.58abc 3.84 ± 0.71abcd 3.71 ±0.43abcd

2.4 肝组织 FXR，AMPK，Nrf2，NF－κB 蛋白表达水平

与 A 组比较，B 组、C1组、C2组、C3组、D 组大鼠肝组织中FXR，AMPK，Nrf2 蛋白表达水平均显著降低，NF －κB 蛋白表达水平均显著升高（P＜ 0.05）；与 B 组比较，C1组、C2组、C3组、D 组大鼠肝组织中 FXR，AMPK，Nrf2 蛋白表达水平均显著升高，NF －κB 蛋白表达水平均显著降低，且C1组、C2组、C3组呈剂量依赖性（P＜ 0.05）；D 组和 C3组大鼠各指标比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）。详见表 4 和图 1。

图1 薯蓣皂苷对TAA 致肝损伤模型大鼠肝组织中FXR，AMPK，Nrf2，NF －κB 蛋白表达水平的影响Fig.1 Effect of diosgenin on the expression levels of FXR，AMPK，Nrf2 and NF－κB protein in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury

表4 薯蓣皂苷对TAA 致肝损伤模型大鼠肝组织中FXR，AMPK，Nrf2，NF － κB 蛋白表达水平的影响（，n ＝10）Tab.4 Effect of diosgenin on the expression levels of FXR，AMPK，Nrf2 and NF－κB protein in liver tissue of model rats with TAA－induced liver injury（，n ＝ 10）

组别A 组B 组C1 组C2 组C3 组D 组剂量（mg／kg）25 50 100 200 FXR 0.93 ±0.07 0.40 ±0.05a 0.51 ±0.07ab 0.59±0.05abc 0.82 ±0.06abcd 0.85 ±0.10abcd AMPK 0.82 ±0.04 0.19 ±0.04a 0.27 ±0.02ab 0.33±0.05abc 0.70 ±0.08abcd 0.72 ±0.06abcd Nrf2 1.05 ±0.13 0.37 ±0.05a 0.43 ±0.07abc 0.52 ±0.08abc 0.94 ±0.10abcd 0.97 ±0.07abcd NF－κB 0.35 ±0.06 0.82 ±0.04a 0.70 ±0.09abc 0.63 ±0.05abc 0.42 ±0.06abcd 0.41 ±0.09abcd

3 讨论

急性肝损伤可由病毒感染、食品添加剂、药物滥用、放射性损伤等引起，并产生亲电子产物和自由基，导致脂质过氧化，炎性细胞浸润和细胞坏死，促进肝损伤进展［11］。薯蓣皂苷是一种甾体皂苷，广泛存在于薯蓣科、豆科、百合科等植物中，具有抗炎和抗氧化应激活性，可降低对乙酰氨基酚诱导的急性肝损伤模型大鼠血清中 ALT 和 AST 的水平，明显改善肝组织病理损伤［12］。若肝脏受损，血液中的AST 和ALT 水平会升高。本研究结果显示，薯蓣皂苷可显著降低TAA 诱导的肝损伤模型大鼠血清中ALT 和AST 的水平，且其治疗效果与临床常用保肝药物水飞蓟素类似，提示薯蓣皂苷可能是治疗急性肝损伤的有效药物。此外，发现薯蓣皂苷可通过抑制氧化应激和炎性反应来改善TAA 诱导的肝损伤。

TNF－α 是参与肝损伤的主要细胞因子，IL－6 可抑制肝细胞再生，抗炎细胞因子IL－10 水平降低可导致炎性反应失衡，增加氧自由基生成，最终导致肝损伤［13］。氧化应激是引起各种肝脏损伤的原因。TAA 可导致肝脏发生严重的氧化应激反应，产生自由基，增加MDA含量，导致肝细胞损伤和凋亡。GSH 和SOD 的抗氧化防御系统可以保护肝细胞免受氧化剂伤害，清除脂质过氧化物和氧自由基，保护肝细胞免受活性氧损伤［14］。本研究结果显示，薯蓣皂苷可显著降低血清中的TNF－α 和IL－6 水平，升高IL－10 水平，同时降低肝组织中MDA含量，提高了GSH 和SOD 活性。

FXR 是一种配体介导的转录因子，在肝脏中呈高表达，可调节AMPK 的磷酸化水平，在氧化应激、炎性反应线粒体功能障碍中起调节作用［15］。许多用于保护细胞的药物可通过激活AMPK 来抑制自由基，并诱导抗氧化酶。AMPK 激活可保护四氯化碳诱导的急性肝损伤，并诱导Nrf2 的表达增强，这在调节抗氧化过程中起重要作用［16］。此外，AMPK 可以抑制 TNF －α 和 IL －6的产生，并抑制NF－κB 的激活。在脂多糖诱导的小鼠急性肝衰竭中，通过降低 TNF－α，IL－1β，IL－6 水平激活 AMPK，抑制炎症，减轻肝损伤［17］。同时，AMPK 不仅在调节上皮细胞小管极化中起关键作用，且对氧化应激有抑制作用。Nrf2 是一种主转录因子，易位进入细胞核，与抗氧化反应元件结合，调控抗氧化基因血红素氧化酶－ 1、NADPH 氧化还原酶等抗氧化应激［18］。活化的NF －κB 增强了细胞因子如 TNF －α 和 IL －1β 的转录，增加了炎性介质合成的持续时间［19］。此外，NF － κB 的激活可升高细胞间黏附因子1（ICAM－1）的表达水平，ICAM－1 是一种跨膜糖蛋白，在嗜中性粒细胞从血液运输到炎性反应部位中起主要作用［20］。本研究结果显示，薯蓣皂苷显著增加了大鼠肝组织中FXR，AMPK，Nrf2 的蛋白表达水平，同时降低了NF－κB 蛋白表达水平，抑制氧化应激和炎性反应。提示FXR／AMPK 信号通路可能是薯蓣皂苷对抗TAA 诱导的急性肝损伤的潜在作用机制。

综上所述，薯蓣皂苷对TAA 诱导的急性肝损伤具有保护作用，可能通过激活FXR／AMPK 信号通路改善肝脏氧化应激和炎性反应发挥作用，为薯蓣皂苷作为一种治疗急性肝损伤的新药提供了理论依据。