柴黄清胰活血颗粒提取工艺研究*

赵 剑，李 静，罗 群，李能源，李 志

（西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000）

柴黄清胰活血颗粒为我院协定处方，由生大黄、柴胡、延胡索、丹参、栀子、黄芩、白芍等14 味中药组方，具有清热解毒、活血消肿、通腑泄热、理气止痛功效，主要用于治疗急性胰腺炎。方中大黄为君药，可抑酶，抑菌，导泻，改善胰腺微循环，抑制内毒素产生，保护胃肠黏膜屏障，抑制肠道内细菌和毒素易位，降低胃肠黏膜和肠血管的通透性，恢复肠道功能，纠正呼吸功能受损患者的低氧血症，降低多器官功能不全综合征、多器官功能衰竭、感染及消化道出血的发生率，提高存活率，改善急性坏死性胰腺炎的预后［1－3］。本研究中以大黄中的指标性成分芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量为评价指标，优选了柴黄清胰活血颗粒的提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC－20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司），配有SPD－20A 型紫外－可见光检测器，LCsolution 型色谱工作站；JPGT0328 型超声提取器（武汉嘉鹏电子有限公司，功率为100 W，频率为40 kHz）；HH 型数显电热恒温水浴箱（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）；ZK072型电热真空干燥箱（上海实验仪器厂有限公司）；AUW120D 型电子天平（日本岛津公司，精度为十万分之一）。

1.2 试药

芦荟大黄素对照品（批号为110795－201308，含量为 99.8%），大黄酸对照品（批号为 0757－200206，含量为 99.5%），大黄素对照品（批号为110756－200110，含量为98.3%），大黄酚对照品（批号为110796－201118，含量为99.1%），大黄素甲醚对照品（批号为110758－201415，含量为98.7%），均购自中国食品药品检定研究院；生大黄、柴胡、延胡索、丹参、栀子、黄芩、白芍等14 味中药材购自泸州天植中药饮片公司，经四川省泸州市药品检验所中药室袁常珍主任中药师鉴定为正品，均符合2015 年版《中国药典（一部）》项下规定；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 5 种大黄指标性成分含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验［4－7］

色谱柱：Inertsil ODS－SP C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 －0.1%磷酸水溶液（85 ∶15，V ／ V）；流速：0.8 mL ／min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。理论板数分别按成分计算均不低于4 000，且分离度良好。

2.1.2 溶液制备

取芦荟大黄素 1.9mg、大黄酸 4.9mg、大黄素 2.9mg、大黄酚 1.7 mg、大黄素甲醚 8.2 mg，精密称定，分别置25，50，25，25，100 mL 容量瓶中，加甲醇超声溶解并定容，得上述成分质量浓度分别为 0.076，0.098，0.116，0.068，0.082 mg ／mL，即得对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液1 mL，置5 mL 容量瓶中，加入甲醇，摇匀，备用，即得混合对照品溶液。

按处方量并以相同工艺制备不含大黄的阴性对照样品，取10 g，精密称定，加甲醇50 mL，浸泡1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL 使溶解，加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚振摇提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，滤过，取续滤液，即得阴性对照品溶液。

分别采用传统水煎、粉碎－渗漉－水煎、渗漉－水煎3 种工艺提取柴黄清胰活血颗粒中14 味中药材，取上述3 种工艺制备的颗粒各10 g，精密称定，加甲醇50 mL，浸泡1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL 使溶解，加盐酸1 mL，加热回流30 min，立即冷却，用乙醚振摇提取2 次，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇溶解，并转移至25 mL 容量瓶中，加甲醇定容，滤过，取续滤液，即得供试品溶液1，2，3。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各 10 μL，按 2.1.1 项下色谱条件进样测定。结果阴性对照品溶液色谱图中，在与对照品溶液及供试品溶液色谱对应保留时间处无相应色谱峰出现，表明阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1 柴黄清胰活血颗粒中5 种大黄指标性成分的高效液相色谱图1. aloe － emodi 2.rhein 3.emodin 4.chrysophanol 5.physcionA.Mixed reference solution B.Test solution C. Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of five active ingredients in Chaihuang Qingyi Huoxue Granules

线性关系考察：精密量取2.1.2 项下对照品贮备液1 mL，置同一5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，再分别量取 1，3，6，10，13，16，20 μL，按 2.1.1 项下色谱条件进样测定，以进样量（ X，μg）为横坐标、峰面积（ Y）为纵坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表1。

表1 5 种大黄指标性成分的线性关系考察结果（n ＝7）Tab.1 Results of linear relation test of five active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma（n ＝ 7）

精密度试验：精密吸取2.1.2 项下混合对照品溶液，按2.1.1 项下色谱条件于 1 d 内重复进样 5 次测定峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的 RSD 分别为 1.44% ，1.41% ，1.41% ，1.47%，0.62%（n ＝5），表明仪器日内精密度良好。精密吸取 2.1.2 项下混合对照品溶液，按 2.1.1 项下色谱条件连续5 d 各进样测定1 次，记录峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的 RSD 分别为 1.51%，1.36%，1.43%，1.42%，0.71% （n ＝5），表明仪器日间精密度良好。

检测限与定量限确定：取芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的对照品贮备液，分别稀释，进样测定，以信噪比（S／ N）为3 时的质量浓度为检测限，以 S／ N为10 时的质量浓度为定量限。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的检测限和定量限分别为0.019 0 μg ／mL 和 0.058 0 μg ／mL，0.024 5 μg ／mL 和0.074 7 μg ／mL，0.029 0 μg ／mL 和 0.088 5 μg ／mL，0.017 0 μg ／mL 和 0.051 9 μg ／mL，0.020 5 μg ／mL 和0.062 5 μg ／mL。

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h 时各进样10 μL，测定峰面积。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚峰面积的 RSD 分别为 1.20% ，0.66% ，1.70% ，1.19% ，1.91% （n ＝6），表明供试品溶液在室温下12 h 内稳定。

重复性试验：取同一供试品溶液6 份，每份10 mL，依法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，并计算含量。结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚含量的 RSD 分别为1.49%，1.49%，1.80%，1.41%，1.48%（n ＝6），表明方法重复性良好。

回收试验：取已知含量的样品5 g，精密称定，平行9 份，每3 份为1 组，分别按5 种大黄指标性成分含量的50%，100%，150%加入芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，依法制备供试品溶液，按2.1.1 项下色谱条件进样测定，并计算回收率。结果上述成分的平均回收率分别为102.08%，101.23%，101.00% ，102.90% ，99.66% ，RSD 分别为 2.70% ，2.25%，1.93% ，2.19% ，2.62% （ n ＝ 9）。

耐用性试验：取样品适量，依法制备供试品溶液，色谱条件小幅变化，流速为（0.8 ± 0.2）mL ／min，检测波长为（254 ±2）nm，柱温为（40 ± 5）℃［8］，测定含量。结果的RSD 分别为 1.32%，0.99%，1.23%，1.19%，1.05%，表明采用高效液相色谱法测定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的含量时，流速、波长、柱温小幅变化，耐用性满足系统适用性试验的要求，方法可靠。

2.2 提取工艺研究

2.2.1 传统水煎工艺

按处方比例称取中药材，采用传统水煎法提取有效成分，以浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的总含量为评价指标，采用 L9（34）正交试验法优选最佳工艺条件。参考文献［9］并结合试验结果，最终确定最佳工艺为加 10 倍量水，浸泡 30 min，煎煮 3 次，每次 60 min。按最佳提取工艺加水提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至密度为1.20 的稠浸膏，加入适量糊精，制得颗粒1。

2.2.2 粉碎－渗漉－水煎提取工艺

将处方中生大黄粉碎，制粒时为母粒。将处方中延胡索、丹参渗滤提取，以乙醇浓度、浸泡时间、加乙醇量、渗漉流速为考察因素，以干浸膏、胡索乙素含量为评价指标，采用 L9（34）正交试验法优选乙醇渗漉工艺最佳条件。参考文献［10］并结合试验结果，最终确定最佳工艺为加10 倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL／min 的速率渗漉。渗漉后，药渣与柴胡、栀子、黄芩等13 味中药材采用传统水煎法提取有效成分，以浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，以栀子苷的转移率为评价指标，采用 L9（34）正交试验法优选最佳工艺条件。参考文献［9］并结合试验结果，最终确定最佳工艺为加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮3 次，每次60 min。按最佳渗滤工艺提取延胡索、丹参，收集渗滤液，浓缩成稠浸膏，备用。将渗滤后的药渣与柴胡、栀子、黄芩等13 味中药材按最佳传统水煎工艺提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至少量，加入渗滤液稠浸膏，继续浓缩至密度为1.15 的稠浸膏，加入生大黄粉和糊精，制得颗粒2。

2.2.3 渗漉－水煎提取工艺

渗漉提取处方中的延胡索、丹参，以乙醇体积分数、浸泡时间、加醇量、渗漉流速为考察因素，以干浸膏、延胡索乙素含量为评价指标，采用 L9（34）正交试验法优选乙醇渗漉工艺最佳条件。参考文献［11］并结合试验结果，最终确定最佳工艺为加10 倍量55%乙醇，浸泡36 h，以3 mL／min 的速率渗漉。生大黄加10 倍量80%乙醇，浸泡 17 h，收集 7 倍量的渗漉液［12］。将上述丹参、延胡索渗漉液和生大黄渗漉液分别进行浓缩，浓缩至稠浸膏，备用。将丹参、延胡索、生大黄渗漉后的药渣及柴胡、栀子、黄芩等11 味中药材采用传统水煎法提取，以浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素，以栀子苷的转移率为评价指标，采用 L9（34）正交试验法优选最佳工艺条件。参考文献［10］并结合试验结果，确定最佳工艺为加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮3 次，每次60 min，将渗滤后的药渣与柴胡、栀子、黄芩等11 味中药按最佳传统水煎工艺提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至少量，加入上述渗滤液稠浸膏，继续浓缩至密度为1.20 的稠浸膏，加入适量糊精，制得颗粒3。

2.3 不同工艺提取结果比较

传统水煎提取工艺操作较简单，为首选工艺，含量测定时发现5 种指标性成分含量及总量均较低，与其水溶性较小相符。改进后，采用粉碎－渗漉－水煎提取工艺，但在沸腾制粒及干燥工艺过程中发现生大黄粉损失较大。渗漉－水煎提取工艺可避免生大黄粉的损失，含量测定结果与预期一致。

由表2 可知，传统水煎提取工艺所得颗粒1 中各成分的总含量为0.466 4 mg／g，粉碎－渗滤－水煎工艺所得颗粒2 中各成分的总含量为0.720 0 mg／g，渗滤－水煎提取工艺所得颗粒3 中各成分的总含量为0.835 7 mg／g。分析各成分的转移率，颗粒3 中各成分的转移率均较高，故选择渗漉－水煎提取工艺。

表2 3 种提取工艺的5 种生大黄指标性成分含量及转移率比较（mg／g，n ＝2）Tab.2 Comparison of contents and transfer rates of five active ingredients in Rhei Radix et Rhizoma extracted by the three extraction processes（mg ／g，n ＝2）

3 讨论

原国家食品药品监督管理总局于2018 年2 月9 日发布的《总局关于对医疗机构应用传统工艺配制中药制剂实施备案管理的公告》中指出，医疗机构开发新制剂从研究成本、申报难易度考虑，按备案制要求申报更容易。但传统水煎提取工艺中5 种生大黄指标性成分的平均含量均较低，临床疗效不佳，故淘汰该工艺。

柴黄清胰活血颗粒处方中生大黄、延胡索、丹参所含有效成分易溶于有机溶剂，不溶或难溶于水［13－18］，故对上述3 味中药材进行醇提。生大黄为方中君药，粉碎，制粒时为母粒，延胡索乙素、丹参采用渗漉工艺，在沸腾制粒及干燥时生大黄均有损失，后期动物实验中，将生大黄粉碎成细粉，加入浸膏中灌胃小鼠，易堵塞灌胃针，且患者也不易服用，故淘汰粉碎－渗漉－水煎提取工艺。

本研究中采用渗漉－水煎提取工艺，即生大黄用80%乙醇渗漉，丹参、延胡索用55%乙醇渗漉，渗漉后的药渣与处方中的其余药材一起加水煎煮，制得颗粒中生大黄指标性成分的总含量最高，各成分转移率均较高，提示该工艺较优。医疗机构新制剂必须依据注册制方案申报，要求完成药效动力学试验与安全性评价试验，但费用较高。自2015 年四川省实行新版医疗机构新制剂注册制管理办法以来，尚无医疗机构新制剂注册成功，是否按渗漉－水煎提取工艺申报医疗机构新制剂有待商榷。