循环miR-155、PDCD4水平与急性心肌梗死患者PCI术后冠脉无复流的关系

苏伟，肖暖，杨金凤

急性心肌梗死（AMI）是由冠状动脉（冠脉）斑块破裂或血管痉挛引起的冠脉血管急性、持续性闭塞而使心肌组织缺血缺氧导致，是世界范围内主要因病死亡原因，发病率呈逐年上升趋势[1]。目前经皮冠脉介入治疗（PCI）被认为是治疗AMI最安全有效的恢复再灌注的手段，但PCI术后冠脉无复流情况时有发生，发生率约5%～25%[2,3]，给患者预后及生活质量带来了严重影响。寻找有效生物学指标早期诊断、早期预防及治疗AMI患者PCI术后冠脉无复流的发生，仍是临床研究热点。目前PCI术后冠脉无复流发生机制尚未明确，研究发现，无复流与心肌细胞微血管痉挛、血管内皮细胞损伤及血管炎性反应有关[4]。微小RNA（miRNA）是一类含多个核苷酸的内源性非编码小RNA，其通过抑调控靶基因的表达参与疾病的病理过程[5]。miR-155是miRNAs家族一员，在多种炎症疾病（如类风湿性关节炎、动脉粥样硬化等）中表达上调[6]。朱江等[7]研究发现，AMI后心力衰竭（心衰）患者血清miR-155水平显著高于健康对照组，且提示其与血管内皮损伤有关。程序性细胞死亡因子4（PDCD4）是新确定的一种抑癌基因，在炎症疾病中作用尚不明确，有研究报道，PDCD4缺失可减少小鼠动脉粥样硬化斑块中脂质沉积，进而减少动脉粥样硬化斑块形成[8]。目前有关miR-155、PDCD4在动脉粥样硬化中的水平研究较多，而有关二者与AMI患者PCI术后冠脉无复流的关系研究鲜有报道，因此本研究分析循环miR-155、PDCD4水平与急性心肌梗死患者PCI术后冠脉无复流的关系，以期为临床探寻早期诊断、预防及治疗AMI患者PCI术后冠脉无复流发生的可靠生物学靶标提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象回顾性分析2018年8月～2020年9月于河北大学附属医院急诊科诊断为AMI行急诊PCI的患者477例为研究对象，其中男性248例，女性229例，年龄40～80岁，平均年龄（60.00±9.85）岁。患者均按照2012年《经皮冠状动脉介入治疗指南（简本）》[9]行PCI治疗（胸痛发作12 h内），术后12 h内按造影结果，参照心肌梗死溶栓治疗临床试验（TIMI）血流分级[10]，分为无复流组86例（0级＜TIMI≤2级），再灌注组391例（2级＜TIMI≤3级）。入选标准：①符合2015《急性心肌梗死诊断和治疗指南》[11]修订版中AMI相关诊断标准；②发病12 h内行急诊PCI治疗者；③持续胸痛＞30 min；④临床基线数据完整者；⑤自愿参与并配合研究者。排除标准：①手术禁忌症患者；②合并严重感染、免疫系统疾病、严重肝脏及肾功能不全、恶性肿瘤者；③急腹症、夹层动脉瘤等患者；④妊娠、哺乳期患者。本研究经我院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器TRIzol试剂（货号：S30876）、逆转录试剂盒（货号：NGB-54415）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）试剂盒（货号：638315）购自上海北诺生物科技有限公司；miR-155、PDCD4及内参U6、GADPH引物由上海生工生物工程有限公司合成；紫外分光光度计（型号：NanoDrop One-w）购自北京智杰方远科技有限公司，qRT-PCR分析仪（型号：SLAN-96P）购自购自日本Olympus公司。

1.3 研究方法

1.3.1 一般资料收集患者的一般资料，包括性别、年龄、体质指数（BMI）、吸烟史、饮酒史、高血压史、糖尿病史、卒中史等；临床血常规基线资料，主要包括白细胞值（WBC）、中性粒细胞值（N）、淋巴细胞值（L）、中性粒细胞/淋巴细胞比值（N/L）；入院次日晨起空腹检测生化指标，主要包括总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GGT）、白蛋白（ALB）、尿酸（UA）、前白蛋白（PA）。

1.3.2 样品采集采集患者术后8 h外周静脉血5 ml于肝素抗凝管中，离心5 min（3000 r/min，离心半径8 cm），分离得到血浆，于-80 ℃冰箱待用。

1.3.3 qRT-PCR法测定血浆miR-155、PDCD4 mRNA表达水平从-80℃冰箱中取出血浆样本，按照RNA试剂盒说明书提取总RNA，参照反转录试剂盒说明将RNA反转录为cDNA。参照实时荧光定量PCR试剂盒说明进行实时荧光定量PCR反应，所用引物序列见表1。反应体系为20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反应程序：95℃预处理20 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。以U6、GADPH作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算受试者血浆miR-155、PDCD4 mRNA相对表达水平。

1.4 统计学分析用SPSS 20.0统计软件对数据进行分析，计量资料以平均值±标准差（）表示，组间比较采用t检验；计数资料用例数及百分比表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson法分析血浆miR-155与PDCD4水平相关性；以AMI患者PCI术后是否发生冠脉无复流为因变量，以单因素分析具有统计学意义因素为自变量进行多因素Logistic回归分析，回归方法采用进入法，效应值用OR值及其95%CI值；绘制受试者工作特征曲线（ROC）分析血浆miR-155、PDCD4水平对AMI患者PCI术后冠脉无复流的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较两组患者在年龄、性别、BMI、吸烟史、饮酒史、糖尿病、卒中基线资料及L、TG、TC、HDL、ALB、UA、PA等实验室指标比较中差异无统计学意义（P＞0.05）；无复流组患者在WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT水平比较中明显高于再灌注组患者（P＜0.05），表2。

2.2 无复流组与再灌注组患者血浆miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平比较与再灌注组患者比较，无复流组患者血浆miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平均明显升高（P＜0.05），表3。

表3 无复流组与再灌注组患者循环miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平比较

2.3 pearson法分析血浆miR-155、PDCD4水平相关性分析如图1所示，生物信息学预测（miRanda网站）显示，miR-155、PDCD4存在结合位点。pearson相关性分析结果显示，AMI患者血浆miR-155与PDCD4 mRNA水平呈正相关（r=0.561，P＜0.05），图2。

图1 血浆miR-155、PDCD4预测结合位点

图2 血浆miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平相关性分析

2.4 多因素Logistic回归分析AMI患者PCI术后冠脉无复流的影响因素以AMI患者PCI术后是否发生冠脉无复流为因变量，排除性别、年龄等混杂因素后，以WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT、循环miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平等上述差异有统计学意义的因素为自变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示，循环miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平高表达是AMI患者PCI术后发生冠脉无复流的独立危险因素（P＜0.05），表4。

表4 AMI患者PCI术后冠脉无复流的影响因素分析

2.5 循环miR-155、PDCD4水平对AMI患者PCI术后冠脉无复流的诊断价值分析循环miR-155水平诊断急性心肌梗死患者PCI术后冠脉无复流AUC为0.812（95%CI：0.756～0.863），截断值为2.91，其灵敏度、特异度分别为66.9%、79.1%；PDCD4 mRNA诊断急性心肌梗死患者PCI术后冠脉无复流的AUC为0.866（95%CI：0.756～0.863），截断值为0.75，其灵敏度、特异度分别为77.6%、87.9%；两者联合诊断的AUC为0.937（95%CI：0.901～0.936），其灵敏度、特异度分别为83.5%、89.7%（图3）。

图3 循环miR-155、PDCD4水平诊断AMI患者PCI术后冠脉无复流的ROC曲线

3 讨论

随着社会发展、现代生活节奏加快、人们生活水平提高及饮食习惯的改变，我国AMI发病率呈逐年升高趋势，AMI是临床常见急危重症，在发达国家被称为“头号杀手”[12,13]。急诊PCI手术是治疗AMI主要手段之一，PCI技术的成熟与改进使得AMI患者远期预后及生存率均有较大改善，但术后约5%～25%患者发生冠脉无复流现象，其是由冠脉闭塞导致血氧供应中断，经手术重建血运时，梗死部位心肌组织无法出现血液灌注的情况，严重影响患者院内不良事件及近远期预后[14,15]。但目前临床仍缺乏对PCI术后冠脉无复流早期准确诊断疾病病情评估的可靠生物学指标。本研究分析循环miR-155、PDCD4水平与AMI患者PCI术后冠脉无复流的关系，以期为寻找早期诊断PCI术后冠脉无复流发生的可靠生物标志物，及早干预改善预后提供一定借鉴。

本研究首先比较患者一般资料，结果显示无复流组患者在WBC、N、N/L、LDL、γ-GGT水平比较中明显高于再灌注组患者。γ-GGT属于氧化应激标志物[16]，因此一般资料表明与再灌注良好者比较，冠脉无复流患者入院时炎症状态，应激反应等均处于更高水平，机体受到更强打击。研究证实，巨噬细胞中过量脂质沉积导致巨噬细胞泡沫化，进一步促进动脉粥样硬化等慢性炎症疾病的发生发展，且由巨噬细胞介导的血管内皮细胞损伤及炎性反应与心肌无复流关系密切[17]。miR-155是典型的多功能miRNA，位于人类21号染色体，大量研究表明其在细胞分化、免疫、血管炎症反应等方面发挥作用，可促进巨噬细胞对脂质的摄取，导致巨噬细胞脂质沉积[18]。有研究报道，抑制miR-155表达水平可减弱心肌梗死巨噬细胞极化和依赖于SOCS1/NF-κB途径的炎症反应，从而减弱心肌梗死引起的交感神经重塑和室性心律失常[19]。本研究结果显示，无复流组患者血浆miR-155/U6水平明显高于再灌注组患者。与既往研究结果一致，提示miR-155异常高表达与AMI患者PCI术后冠脉无复流的发生有关。

PDCD4是一种抑癌基因，也是一种由巨噬细胞分泌的典型炎性介质，可激活Toll样受体4（TLR4）信号通路，促进巨噬细胞脂质沉积，从而促进动脉粥样硬化斑块形成[20]。肖静等[21]研究发现，抑制心脏干细胞PDCD4表达水平可明显减少心肌细胞凋亡，为临床治疗心肌梗死提供新方向。本研究结果显示，无复流组患者血浆PDCD4水平明显高于再灌注组患者。与肖静等研究结果趋势一致，提示血浆PDCD4异常高表达可能与AMI患者PCI术后冠脉无复流发生关系密切。有学者在动物实验研究中发现，miR-155可通过正性调控其靶基因PDCD4，从而过度激活血管炎症反应，加重冠脉粥样硬化性病变[22]。本研究生物信息学预测（miRanda网站）显示，miR-155、PDCD4存在结合位点且AMI患者血浆miR-155/U6与PDCD4 mRNA水平呈正相关。提示血浆miR-155、PDCD4可能发挥正向调控作用共同参与AMI患者PCI术后冠脉无复流发生，在重建血运时，心肌梗死部位心肌组织无法出现血液灌注的具体机制有待进一步深入研究。本研究进一步分析显示，血浆miR-155/U6、PDCD4 mRNA水平高表达均是AMI患者PCI术后发生冠脉无复流的独立危险因素，提示miR-155、PDCD4高表达AMI患者发生PCI术后冠脉无复流风险较大，对此类患者在治疗和术后恢复中应给予更多关注。基于血浆miR-155、PDCD4在PCI术后发生冠脉无复流患者中异常高表达，推测二者对PCI术后发生冠脉无复流有一定诊断价值，进一步ROC分析结果显示，miR-155、PDCD4诊断AMI患者PCI术后冠脉无复流的AUC分别为0.812、0.866，两者联合诊断的AUC为0.937。说明miR-155、PDCD4联合检测对AMI患者PCI术后冠脉无复流有较高诊断价值，可为临床提供一定参考。

综上所述，血浆miR-155、PDCD4水平异常高表达可能与AMI患者PCI术后冠脉无复流发生有关，二者联合检测对AMI患者PCI术后冠脉无复流有较高诊断效能，可为临床早期评估患者PCI术后冠脉无复流并采取及早采取措施进行改善有一定意义。而本研究并未对血浆miR-155、PDCD4与PCI术后冠脉无复流发生的具体作用机制进行探讨，后期应进行深入阐述。