鳀鱼中摩氏摩根菌的分离鉴定及药敏试验

李 娟，刘秋晨，李晶晶，林 洋，李志兴，王 庭，刘 艳，2，单春乔*

(1.大连三仪动物药品有限公司，辽宁大连 116036；2.江苏三仪生物工程有限公司，江苏邳州 221300)

鳀鱼(Engraulisjaponicus)属于鲱形目、鳀科(Engraulidae)、鳀属(Engraulis)，是一种生活在温带海洋中上层的小型鱼类，又名鳁抽条，海蜒，离水烂，老眼屎，鲅鱼食，分布于北太平洋西部，我国广泛分布于东海、黄海和渤海[1]。鳀鱼是其他经济鱼类的饵料生物，由于鳀鱼个体小，易腐烂，不能长时间储存，因此鳀鱼是制作鱼粉的优质原料[2]，而鱼粉是水产和乳仔猪饲料优质的动物蛋白质原料[3]。我国是既是水产养殖大国[4]，也是饲料原料进口和消耗大国[5]，饲料的安全与否对养殖业的健康发展有着至关重要的影响。非洲猪瘟的暴发使人们意识到饲料及饲料原料是携带和传播病原性细菌和病毒的重要载体。因此，鳀鱼品质的高低对净化水产饲料具有重要意义，同时也会直接影响水产养殖业的经济效益。

本研究从冷冻的鳀鱼中分离出1株细菌，并对其进行细菌分离、形态学观察、生化鉴定、16S rDNA基因序列分析及构建系统发育树对分离菌进行鉴定，确定为摩氏摩根菌，同时采用Kriby-Bauer纸片扩散法对分离菌株TY进行耐药性分析，以期得到对鳀鱼中摩氏摩根菌有效的抗菌药物，为实际应用提供有效的解决办法，同时也为实际生产中预防致病性病原菌来源提供可参考的方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 冷冻鳀鱼10 kg，辽宁省葫芦岛某鱼粉厂提供。

1.1.2 主要试剂 亚硫酸铋琼脂培养基、缓冲蛋白胨水培养基、营养琼脂培养基、细菌生化鉴定管，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品；药敏纸片，杭州微生物试剂有限公司产品；TaqPlus DNA 聚合酶 、10×PCR buffer(含Mg2+)、dNTP(10 mmol/L)、DNA Ladder Mix Maker、引物、Ezup 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；DNA Marker DL 3 000，TaKaRa公司产品；引物，生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3 主要仪器 恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂产品；恒温摇床，上海精宏试验设备有限公司产品；低温高速离心机、高压蒸汽灭菌锅，厦门致徽仪器有限公司产品；超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；PCR仪、凝胶成像仪，美国伯乐产品；电泳仪 、稳压电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离及形态学观察 随机挑选25条鳀鱼，无菌采集鳀鱼的腮、肠道磨碎加入装有缓冲蛋白胨水(BPW)培养基无菌锥形瓶内增菌，37 ℃±1 ℃培养24 h±1h，用接种环取1环增菌液接种到亚硫酸铋琼脂(BS)培养基上，37 ℃±1 ℃培养48 h±1 h，将单菌落进行革兰氏染色镜检。并挑取可疑菌落接种于营养琼脂培养基上37 ℃±1 ℃培养24 h±1 h进行分离纯化，观察细菌生长情况及菌落特征。

1.2.2 分离菌的生化鉴定 将纯化后的菌落无菌接种于细菌微量生化鉴定管中，按其要求进行培养观察，并参照《常见细菌系统鉴定手册》判定结果。

1.2.3 细菌16S rDNA的扩增和测序 用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌株的基因，用 16S rDNA通用引物，进行16S rDNA PCR扩增。引物序列为:上游引物: 5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；下游引物:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；25 μL 扩增体系：25 Template(基因组DNA 20 ng/μL～50 ng/μL)0.5 μL，10×buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL，酶0.2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，加双蒸H2O至25 μL。PCR扩增程序：94℃预变性4 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃ 终止反应20 min。取5 μL PCR扩增产物，进行点样。用DNA分子量标记物做参照。150 V、100 mA 电泳20 min，电泳检测结果用凝胶成像仪记录并保存。用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒进行PCR产物回收，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4 细菌16S rDNA系统进化树的构建与分析 将所测序列提到交GenBank，利用Blast对所测序列与GenBank上收录的16S rDNA基因核苷酸序列进行同源性搜索。采用Mega6.0构建系统发育进化树。

1.2.5 药敏试验 采用标准Kriby-Bauer纸片扩散法对已分离的摩氏摩根菌进行常用抗菌药物的敏感性检测，并根据美国临床实验室标准委员会(CLSI/NCCSL)LY2014执行标准判定摩氏摩根菌对药物的敏感性。药敏试验中所用的9种抗菌药物包括头孢哌酮、头孢他啶、头孢氨苄、头孢拉定、链霉素、新霉素、阿奇霉素、强力霉素、恩诺沙星。

2 结果

2.1 细菌的形态学特征

分离菌株在BS培养基上生长状态良好，培养48 h，菌落呈浅绿色，圆形，凸起。革兰氏染色阴性菌，短杆状，两端钝圆。纯化后在营养琼脂上生长良好，菌落呈乳白色，表面光滑，凸起，圆形。将该菌株命名为TY。

2.2 生化鉴定

分离菌株TY生化鉴定结果见表1。由表1可知，葡萄糖发酵、运动性、鸟氨酸、氰化钾为阳性；麦芽糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、硫化氢、山梨醇、蛋白胨为阴性，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，分离菌株TY初步鉴定为摩氏摩根菌。

表1 分菌菌株TY生化鉴定结果

2.3 16S rDNA鉴定

分离菌株TY所扩增的16S rDNA基因序列长度为1 475 bp，PCR扩增结果见图1。通过NCBI的Blast系统进行检索，选择同源性较高的序列，采用Mega6.0绘制成进化树。结果表明，该菌株TY与摩氏摩根菌的16S rDNA 基因序列自然聚为一支，结果见图2。通过16S rDNA序列鉴定进一步确定分离菌株TY为摩氏摩根菌。

图2 菌株TY 16 S rDNA序列的系统进化树

M.DNA 标准DL 3 000;1.菌株TY

2.4 药敏试验结果

药敏试验结果表明，分离菌株TY对头孢哌酮、头孢他啶、 链霉素、恩诺沙星、新霉素敏感，对头孢氨苄、阿奇霉素、头孢拉定、强力霉素表现耐药。结果见表2。

表2 分离菌株TY药敏性

3 讨论

细菌性疾病是水产养殖过程中最常见、危害最大的一类传染性疾病，在鱼类和两栖类中均分离到多种致病菌[6]。摩氏摩根菌(M.morganii)是革兰氏阴性菌，形态及生化反应特征均与变形杆菌相似，但无迁徙现象。摩氏摩根菌是条件致病菌，是人畜鱼共患致病菌，是医源性感染的重要病原菌之一，可致人的各种感染，包括泌尿道感染和脓肿等[7]；在水产动物方面，能导致锦鲤出现溃烂、口腔和肠道出血、充血[8]，大鲵[9]、中华鳖[10]、黄喉拟水龟头肢溃烂[11]，能造成中国台湾泥鳅死亡[12]，在患病鲈鱼体内分离出了摩氏摩根菌[13]；在畜禽方面，有报道称摩氏摩根菌能导致肉鸡发生机会性感染而导致死亡[13]，从健康黑山羊上呼吸道分离到对小鼠具有较强致病性的摩氏摩根菌[14]，从新鲜的鸡蛋中也分离出了摩氏摩根菌[15]。但是目前尚未有关于从鳀鱼中分离出的摩氏摩根菌的报道，本研究通过传统生化鉴定方法结合。16 S rDNA菌种鉴定的方法从水产饲料原料鳀鱼中分离出1株摩氏摩根菌TY。

2019年，国家农业农村部发布194号公告，自2020年1月1日起，我国饲料中全面禁止添加促生长类抗生素，减少滥用抗生素造成的危害，维护动物源食品安全和公共卫生安全。但是在水产养殖中，对于致病菌防治与治疗，仍然以抗菌药物为主[16]。持续使用一定剂量有效的抗菌药物后，会出现药效减弱或完全消失的现象，这是因为病原菌对抗菌药物产生了抗性或耐药性，即产生了耐药菌株[17]。耐药菌株的产生使得生产上用药量越来越大，药效越来越差，既增加了生产成本，又增加了防治难度。本试验中所筛选的摩氏摩根菌对第一代头孢菌素头孢氨苄、头孢拉定，大环内酯类阿奇霉素，四环素类强力霉素表现耐药；对第三代头孢菌素类头孢哌酮、头孢他啶，氨基糖苷类链霉素、新霉素，喹诺酮类恩诺沙星表现敏感。虽然作为饲料原料是不得检出沙门氏菌、志贺氏菌以及其他致病菌，但是也不能排除其作为细菌或者病毒载体的可能性。

综上所述，本研究从鱼粉原料鳀鱼中分离出的1株摩氏摩根菌，并对其进行了耐药性分析。这为饲料原料中病原菌的分离提供了理论依据，有一定的参考价值。同时，在水产及畜禽养殖过程中，对于致病菌来源提供了可参考的方向。