双酶法制备羊栖菜多肽的工艺研究

◎ 李爱英，冯秀静，庞庭才

（1.崇左幼儿师范高等专科学校，广西 崇左 532200；2.北部湾大学，广西 钦州 535000）

羊栖菜（Sargassum fusiforme），别名海大麦[1]，属于海洋藻类植物，藻体黄褐色，肥厚多汁。羊栖菜营养丰富，富含多种对人体有益的微量元素和某些特殊的生物特性，长期食用能使人的皮肤光滑滋润，羊栖菜中的多糖对肿瘤具有免疫力[2]，能促进造血功能和防止高血压[3]，适量食用羊栖菜可改善咽喉肿痛、口舌生疮的症状。

我国的羊栖菜虽然资源丰富，但是由于新鲜的羊栖菜不利于长期储藏和运输，因此不能满足消费者的需求，为了充分利用羊栖菜丰富的营养成分和药用价值，将羊栖菜的蛋白质提取出来并通过甲醛滴定法[5-7]测定其水解度，研制出精深加工的营养保健酒品[8-9]，力求最大限度地利用其营养成分，扩大消费区域，满足全国人们不断增长的营养需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

羊栖菜，广东雷州半岛2015年所产；标准氢氧化钠、中性甲醛溶液、百里酚酞、中性红指示剂，广州凯尔化工科技有限公司；碱性蛋白酶（20万U·g-1）、木瓜蛋白酶（6万U·g-1），南宁东恒华道生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；超高速多功能粉碎机，市康市善竹贸易有限公司；数显恒温水浴锅，上海跃进医疗器械有限公司；磁力搅拌器，上海龙跃仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 藻蛋白水解的工艺流程

藻蛋白水解的工艺流程：晒干的羊栖菜用自来水浸泡0.5~1 h→清洗→石油醚回流→粉碎、过筛、浸提→离心、沉淀→成品羊栖菜蛋白→双酶水解藻蛋白。

1.3.2 水解度的测定

采用甲醛滴定法[4]测定水解度。水解度（Degree of Hydrolysis，DH）计算公式如下所示：

式中：C-NaOH标准溶液的浓度，mol·L-1；V-酶解液消耗NaOH标准溶液的体积， mL；V0-未酶解液（空白）消耗NaOH标准溶液的体积，mL；0.014-氮毫克当量；N-底物样品总氮含量，g。

1.3.3 单酶和双酶分别对羊栖菜蛋白水解度大小的比较

取同质量的羊栖菜蛋白质溶于蒸馏水，分别加入单酶（碱性蛋白酶/木瓜蛋白酶），并使用双酶法A和双酶法B处理羊栖菜蛋白，以水解度大小为指标进行比较试验。

1.3.4 单因素设计试验

根据不同因素对水解度的影响，选取水解温度、时间、pH、酶底比4个因素，进行单因素试验[8]。

1.3.5 响应面试验设计

从4个单因素中选出条件最佳，以酶底比A、温度B、pHC、时间D为自变量，水解度为响应面值，采用4因素3水平进行响应面分析优化，见表1。

表1 响应面分析因素和水平表

2 结果与分析

2.1 单酶和双酶对羊栖菜蛋白水解度大小的比较结果

由表2可知，双酶法B水解羊栖菜蛋白所得的水解度最高，说明双酶法比单酶法效果更好。对双酶法的比例进一步探究，且由表3可知，两种酶比例为1∶1时，水解效果更好。根据酶具有专一性的特点进行分析，第二种酶是利用第一种酶水解后的产物进行水解，第二种酶对前一种酶未水解完全的羊栖菜蛋白进行水解，不同的酶对蛋白质水解产物的方式不同，这都会使蛋白水解度得到提高，使羊栖菜蛋白水解更加彻底。

表2 酶量的确定表

表3 双酶法的用量确定表

2.2 单因素试验结果与分析

2.2.1 酶与底物浓度的比例对水解程度的影响

由图1可知，随着酶与底物浓度的上升水解度愈加明显，酶底比为4%增加到8%时水解度变化不明显，原因是提取液基本达到饱和。当酶底比大于8%时，水解度呈下降趋势。

图1 酶与底物浓度的比例对水解程度的影响图

2.2.2 温度对水解度的影响

由图2可知，水解度随着温度的升高而升高，到达一定温度时水解度降低。温度从50 ℃增加到60 ℃时水解度明显大幅提高，说明加热能使化学反应速率加快。在60 ℃时水解度达到最高值41.32%。当温度从60 ℃到70 ℃时，水解度大幅度下降。

图2 温度对水解度的影响

2.2.3 pH对水解度的影响

由图3可知，随着pH的变化，水解度先提高后降低，当pH由5.5增加到6.5时，水解度达到最大值26.78%。当pH大于6.5时，水解度呈大幅度下降，原因可能是偏碱性环境下使酶的空间结构发生了改变，酶的活力部位处于离解状态，因此影响到酶与底物的结合。

图3 pH对水解度的影响图

2.2.4 时间对水解程度的影响

由图4可知，随着酶解时间的延长，水解度先提高后缓慢降低，原因可能是部分底物蛋白质的结构被破坏，部分酶失活，影响了酶解效果，当酶解时间为180 min时水解度达到最大值42.56%，酶解时间继续延长，水解度小幅度降低，由42.56%变化到37.62%。

图4 时间对水解程度的影响

3 时间对水解程度的影响

3.1 响应面试验结果分析

3.1.1 响应面结果

根据单因素试验结果，采用Box-Behnken模型，以酶与底物比例A，水解温度B，pH值C和水解时间D4个因素为自变量，并以-1、0、+1分别代表自变量的低、中、高水平，对自变量进行编码，水解度为响应面Y值。通过软件Design-Expert对响应面进行统计分析，同时对结果进行统计分析，结果如表4所示。

表4 响应面设计方案与结果表

3.1.2 回归方程拟合及方差分析

软件Design-Expert对响应面结果进行二次回归分析，拟合得到回归方程为：Y=41.56-0.33A+1.04B+0.74C-0.17D+0.47AB+0.017AC+0.39AD+0.063BC+0.095BD-0.81CD-0.50A2-1.80B2-1.68C2-2.12D2。

为了检验方程的有效性，对双酶法水解羊栖菜蛋白的数学模型进行方差分析，结果如表5所示。由表5可知，模型一次项B影响极其显著（P<0.01），一次项C影响显著（P<0.05）；一次项A、D因素对水解度大小影响均不够显著。温度对水解度大小的影响极其显著；水解温度、时间和pH的二次项对水解度大小比较显著；二次交互项是不够显著的，由此可进行分析预测：时间、温度、pH3个因素的交互项对双酶水解羊栖菜蛋白水解度的影响显著，各因素之间有交互作用[10]。从表5可以看出，各因素对羊栖菜蛋白水解度大小的影响排列顺序为水解温度＞pH＞酶底比＞水解时间。

表5 二次响应面回归模型系数显著性检验结果表

模型P=0.018 4＜0.05，这表明二次方差模拟显著，对于回归方程的失拟项检验P=0.067 6，不显著，这说明试验因数外的未知量干扰不大。回归方程的负相关系数R2=0.879，说明响应面的回归关系显著，表明回归方程与试验情况拟合较好。说明了响应面回归方程能预测双酶水解羊栖菜蛋白水解度的变化，反映了水解度与pH、酶底比、温度和时间存在密切的关系。

3.1.3 响应面图分析

由响应面图分析结论可知，羊栖菜蛋白质水解的最佳参数为酶底比6%,水解的温度60 ℃，pH为6.5，时间195 min。

3.2 验证性试验

将响应面优化参数修正后，实际的操作条件为酶底比6%,水解的温度60 ℃，pH为6.5，时间180 min。实际测得羊栖菜蛋白质的水解度为41.73%，与模型预测值相近。通过验证试验，羊栖菜蛋白的水解度为41.73%，与理论值41.82%的误差0.09%。验证了回归模型预测个因素与提取率之间关系的可靠性。

4 结论与分析

本文通过因素试验和响应面分析方法，对羊栖菜多肽的制备工艺进行优化分析，通过软件Design-Expert的回归模型得出最佳的工艺制备条件理论值为：水解温度61.29 ℃、水解pH 6.62、水解酶底比5.76%、水解时间180 min、水解度为41.829 5%。考虑到实际操作过程的限制条件，在验证试验中把制备羊栖菜多肽的最佳工艺条件设为温度60 ℃、水解pH 6.5、水解酶底比6 %、水解时间180 min，羊栖菜蛋白液的水解度为41.73%，与理论值误差0.099 5%。各因素对羊栖菜蛋白水解度大小的影响排列顺序为水解温度＞pH＞酶底比＞水解时间。这说明影响酶活力的因素很多，其主要因素有温度、pH和底物浓度，次要因素有时间和金属离子等，这些因素通过破坏酶的空间结构和影响活性部位结合基团，使酶失去活性，或是通过破坏底物（蛋白质）的空间结构，使底物不能分解产物与底物进行化学反应。由于水解度的提高也会使羊栖菜蛋白转化为小分子多肽的概率提高，肽的产率也相应增加，为提高产品的营养价值和药用成分，并为进一步研制营养保健品或其他精深加工产品提供了途径。