鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠过氧化和免疫失调的影响

吴敬峰 ，赵亚丹 ，朱文明 ，及超，李聪杰

（1.保定市第二医院骨二科，河北保定 071000；2.河北大学附属医院骨科，河北保定 071000）

骨质疏松症是因机体骨量降低、骨结构被破坏所致骨脆性升高的一种全身性代谢性骨疾病，属于一种退行性疾病[1]。女性绝经所致骨质疏松症是临床骨质疏松症常见类型之一，由于绝经后体内雌性激素水平降低，导致骨生物力学性能降低，从而增加女性绝经骨质疏松症风险，对女性的主要公共卫生存在威胁[2]。因此，预防绝经后骨质疏松症已成为骨科研究重点之一。绝经后骨质疏松症发病机制至今尚未完全阐明，可能与炎症反应、氧化应激过强以及相关蛋白表达异常有关。已有研究[3]表明，给予抗炎、抗氧化治疗可有效缓解绝经后骨质疏松症临床症状，目前临床治疗骨质疏松症常用药物主要为钙剂、维生素D、雌激素等，虽然表现出一定程度的治疗效果，但是仍旧无法满足骨质疏松症的临床预防要求。因此，急需寻找新的预防骨质疏松症药物。鱼腥草是广泛分布于中国、日本、韩国和泰国等亚洲国家的一种多年生草本植物，其中活性成分具有抗氧、抗炎和提高免疫力等作用[4]。鱼腥草总黄酮为鱼腥草成分之一，具有抑菌、抗过敏、延缓衰老和抗辐射等作用[5]。有研究[6]表明鱼腥草挥发油可改善骨质疏松症症状，但是鱼腥草总黄酮是否具有相似作用尚不明确。本研究旨在探讨鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD雌性大鼠75只，4周龄，体质量210～250 g，购于河北省实验动物中心，生产许可证号SCⅩK（冀）2018-004，购回后于适应性饲养1 周，本研究均按照善待实验动物的指导性意见进行操作[7]。

1.2 主要试剂

鱼腥草总黄酮（郑州康吉元生物科技有限公司，1∶10）；破骨细胞相关受体（osteoclast-associated receptor，OSCAR）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）抗体（美国Abcam 公司）；超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、白介素-17（interleukin-17，IL-17）、白介素-23（interleukin-23，IL-23）和白介素-10（Interleukin-10，IL-10）试剂盒（武汉博士德生物技术有限公司）；HE 染色试剂盒、番红染色试剂盒（美国Sigma公司）。

1.3 主要仪器

LCT200 Micro-CT 机（汇佳生物有限公司）；5910R 冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；HALO MPR-96 酶标仪（瑞士Dynamica 公司）；ECHO revolve FL显微镜（美国ECHO公司）。

1.4 动物分组及干预

将75 只雌性SD 大鼠均分为假手术组、模型组和鱼腥草总黄酮低、中、高剂量组，除假手术组外其余各组大鼠均采用双侧卵巢切除术制备骨质疏松症大鼠模型，详细操作见文献[8]，鱼腥草总黄酮低、中、高剂量组术后分别灌胃0.5、1.0、2.0 g/kg 鱼腥总黄酮[9]干预，假手术组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水，连续干预4周。

1.5 骨指标检测

末次给药后24 h，使用Micro-CT 扫描检测各组大鼠干预后骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、特定骨表面积（trabecular bone surface/bone volume，BSA/BV）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular bone space，Tb.Sp），扫描参数为90 kV、45 μA，曝光1 000 ms，扫描厚度12 μm，扫描角度360°。

1.6 HE染色和番红染色

末次给药后24 h，颈椎脱臼法处死大鼠，分离出胫骨，固定于4%（φ）多聚甲醛溶液中，经脱钙、脱水处理后，进行石蜡包埋、切片，将所得片子用于HE染色、番红染色，使用Image pro plus 系统分析骨小梁、软骨占骨组织的百分比。

1.7 RT-PCR 检测骨组织中OSCAR 和TRAP 基因表达

使用TRIzol法提取骨组织匀浆中总RNA，检测RNA 的完整性和浓度，合成cDNA 第一条链，将其作为RT-PCR 扩增模板，扩增条件为95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、34 s，总计40 个循环，采用2-△△Ct法计算OSCAR和TRAPmRNA相对水平。

1.8 Western blot检测骨组织中OSCAR、TRAP 蛋白水平

提取骨组织匀浆总蛋白，考马斯亮蓝调整蛋白浓度至一致，然后依次经过SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至PVDF 膜、5%脱脂奶粉密封2 h，然后加入兔多抗OSCAR、TRAP、ACTIN 一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜，PBST 漂洗，加入HRP 标记二抗（1∶500）孵育1 h，PBST 漂洗，加入ECL 显色溶液，曝光，使用Image J软件分析各组目标条带的相对灰度值。

1.9 骨组织SOD、MDA和GSH水平检测

取骨组织匀浆，1 200 r/min 条件下离心10 min，取上清液备用，使用ELISA 法检测上清液中SOD、MDA和GSH水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.10 外周血和骨组织中IL-17、IL-23 和IL-10 的含量检测

骨组织匀浆上清液制备同“1.9”，取大鼠外周血2 mL，3 500 r/min 条件下离心15 min，取上清液备用，使用ELISA 法检测骨组织匀浆和外周血上清液中IL-17、IL-23 和IL-10 水平，按照试剂盒说明书进行操作。

1.11 统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK法检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠骨指标的影响

如图1 所示，与假手术组比较，模型组BV/TV、Tb.Th显著降低（P＜0.05），BSA/BV、Tb.Sp显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，鱼腥草总黄酮中、高剂量组BV/TV、Tb.Th 显著升高（P＜0.05），BSA/BV、Tb.Sp显著降低（P＜0.05）；鱼腥草总黄酮低剂量组的BV/TV、Tb.Th、BSA/BV、Tb.Sp 与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠骨指标的影响Figure 1 Effects of total flavonoids from Houttuynia cordata Thuub.on bone indexes in rats with osteoporosis

2.2 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠软骨组织的影响

HE 染色（图2）结果显示，假手术组和鱼腥草总黄酮低剂量组大鼠软骨面较为光滑、细胞排列整齐，模型组大鼠软骨表面存在有细胞丢失，鱼腥草总黄酮中、高剂量组大鼠软骨损伤程度得到缓解。番红染色（图3）结果显示，假手术组和鱼腥草总黄酮低剂量组大鼠软骨表面光滑、细胞分布均匀且染色均匀，模型组大鼠软骨细胞排列紊乱、番红着色差，鱼腥草总黄酮中、高剂量组大鼠软骨细胞排列紊乱、番红不易着色情况得到改善。

图2 各组大鼠软骨组织HE染色（400×）Figure 2 Images of HE staining showed cartilage tissues of rats in each group（400×）

图3 各组大鼠软骨组织番红染色（400×）Figure 3 Images of Safranin staining showed cartilage tissues of rats in each group(400×)

2.3 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠骨小梁和软骨的影响

如图4所示，与假手术组比较，模型组骨小梁和软骨含量降低（P＜0.05）；与模型组比较，鱼腥草总黄酮中、高剂量组骨小梁和软骨含量升高（P＜0.05）。

图4 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠骨小梁和软骨的影响Figure 4 Effects of total flavonoids from H.cordata on trabecular bones and cartilages in rats with osteoporosis

2.4 鱼腥草总黄酮对骨组织SOD、MDA 和GSH 水平的影响

与假手术组相比，模型组骨组织SOD 水平降低（P＜0.05），骨组织MDA、GSH 水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，鱼腥草总黄酮中、高剂量组骨组织SOD 水平升高（P＜0.05），骨组织MDA、GSH 水平降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组骨组织SOD、MDA和GSH水平比较Table 1 Comparison of SOD,MDA and GSH levels in bone tissues among all groups(n=7)

2.5 鱼腥草总黄酮对骨吸收功能相关基因OSCAR和TRAP表达的影响

如图5所示，与假手术组比较，模型组OSCAR和TRAP基因及蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，鱼腥草总黄酮中、高剂量组OSCAR和TRAP基因及蛋白水平降低（P＜0.05）。

图5 鱼腥草总黄酮对骨吸收功能相关基因OSCAR和TRAP表达的影响Figure 5 Effects of total flavonoids from H.cordata on the expressions of bone resorption function related genes OSCAR and TRAP

2.6 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠L-17、IL-23和IL-10水平的影响

如图6所示，与假手术组比较，模型组骨组织和外周血IL-17、IL-23、IL-10 含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，鱼腥草总黄酮中、高剂量组骨组织和外周血IL-17、IL-23水平显著降低（P＜0.05），骨组织和外周血IL-10含量显著升高（P＜0.05）。

图6 鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠IL-17、IL-23和IL-10水平的影响Figure 6 Effects of total flavonoids from H.cordata on levels of IL-17，IL-23 and IL-10 in rats with osteoporosis

3 讨论

骨质疏松症所致骨折与成骨细胞形成和破骨细胞吸收不平衡有密切关系[10]，其发生与雌激素缺乏、持续性钙损失、饮食习惯、日常活动以及药物使用等情况有关[11-12]。鱼腥草可作为中药和食用植物，具有清热解毒、消肿、利尿等功效，可用于溃疡、脓疮、腹泻、湿疹等疾病治疗[13]。鱼腥草总黄酮是鱼腥草主要活性成分之一，有研究[14]表明鱼腥草总黄酮可调节人乳腺癌细胞凋亡进程，本研究结果显示鱼腥草总黄酮（1.0 g/kg）可以提高骨质疏松症大鼠BV/TV、Tb.Th，降低BSA/BV、Tb.Sp。BV/TV 水平高低可以反映骨小梁的多少，水平升高说明骨合成代谢高于骨分解代谢[15]，骨质疏松症患者Tb.Th 呈降低状态[16]。Tb.Sp主要体现松质骨微结构，其异常升高可以反映骨质存在疏松[17]。本研究结果说明鱼腥草总黄酮可以改善骨质疏松症大鼠的骨质疏松症状。

骨小梁是影响骨强度的重要因素之一，发挥着承载负荷作用。软骨是由软骨细胞和细胞间质组成的组织，具有维持关节稳定性、增加抗压能力和支撑作用[18]。本研究结果显示骨质疏松症大鼠存在软骨表面细胞丢失和骨小梁、软骨含量降低情况，而鱼腥草总黄酮处理可以逆转上述趋势，说明鱼腥草总黄酮（1.0 g/kg）可以提高骨质疏松症大鼠骨小梁和软骨水平。成骨分化能力削弱或抑制是引起骨质疏松症的重要因素之一，直接原因是骨形成速度低于骨吸收速度。本研究结果显示骨质疏松症大鼠骨组织中的OSCAR和TRAP基因、蛋白水平升高，OSCAR和TRAP均为骨吸收相关因子，OSCAR可在破骨细胞中表达升高并参与破骨细胞的生成过程，说明骨质疏松症大鼠骨吸收能力增强，而骨形成能力降低。通过鱼腥草总黄酮1.0 g/kg处理可以调节骨吸收，从而保护骨组织，此结果与文献[19]趋势相似。

骨质疏松症发病还与氧化应激、炎症反应有关，本研究发现骨质疏松症大鼠体内氧化应激和炎症反应情况较健康大鼠增强，而给予鱼腥草总黄酮1.0 g/kg处理可以降低MDA、GSH、IL-17、IL-23 水平，升高SOD 和IL-10含量。SOD 是具有清除氧自由基的抗氧化酶，MDA 是具有细胞毒性的脂质氧化产物，GSH 参与体内氧化还原反应。IL-10 是由调节性T细胞分泌的抗炎性细胞因子，对T 细胞及抗原细胞信号的传递具有抑制作用，从而实现对炎性细胞因子合成和抗体分泌的抑制作用。IL-17、IL-23 是由Th1 细胞分泌的促炎因子，IL-17 可以促进中性粒细胞炎症趋化因子的生长和表达，加重炎症反应[20]。有研究[21]表明鱼腥草具有抗氧化作用，本研究结果也呈现出相似趋势，说明适宜浓度鱼腥草总黄酮处理可以减低骨质疏松症大鼠体内氧化应激和炎症反应，实现对骨组织的保护作用。

综上所述，鱼腥草总黄酮可以改善骨质疏松症大鼠骨量减少情况，改善软骨损伤严重程度，还可降低骨质疏松大鼠氧化应激和炎症反应，改善骨质疏松症大鼠的成/破骨细胞间的功能平衡。本研究初步显示鱼腥草总黄酮对骨质疏松症大鼠的骨损伤有预防作用，其具体的作用机制及可能涉及的信号通路还需要进一步研究。