β-榄香烯对肺炎克雷伯菌致急性肺炎大鼠的保护作用

夏耀宗 ，施绍瑞 ，胡伟 ，刘翔，付杰

（1.宜宾市第二人民医院检验科，四川宜宾 644000；2.第三军医大学附属新桥医院检验科，重庆 400037）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一种革兰阴性致病菌，可引起尿路感染、肺炎等多种感染，其中克雷伯菌引发的肺炎在免疫功能低下的患者中尤为严重，死亡率在25%～60%之间[1]。在细菌性肺炎模型中，病原体到达下呼吸道，繁殖引起肺泡毛细血管充血、水肿、肺泡纤维蛋白渗出、细胞浸润等炎性症状，产生大量炎症因子，加重机体炎症反应。β-榄香烯是从中药莪术根茎中提取的一种非细胞毒性的抗肿瘤药物，该化合物具有消炎和抗肿瘤特性，能够通过血脑屏障。目前已报道β-榄香烯在体外和体内具有多种生物活性，如抗肿瘤[2]、多重耐药性[3]和免疫调节[4-5]作用，但其抗炎作用仍不清楚。因此，本研究拟通过克雷伯菌复制大鼠急性肺炎模型，探索β-榄香烯对克雷伯菌致急性肺炎大鼠外周血中肺组织炎症因子及纤维化指标的影响，及ERK1/2 和AKT 信号通路的参与情况，以期为急性肺炎临床用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

45 只5～8 月 龄SPF 级健康成年雄性Sprague Dawleg（SD）大鼠，体质量180～260 g，购自四川大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCⅩK（川）2018-026，动物使用的伦理审批号：LLPZ-016。

1.2 主要仪器

5430R高速离心机（德国Eppendorf公司）；Varioskan LUⅩ多功能酶标仪（美国赛默飞公司）；Eclipse 80i显微镜（日本尼康公司）；AMA440N 高压灭菌锅（英国Astell 公司）；ABI StepOnePlus TM 荧光定量PCR仪（美国基因仪器公司）。

1.3 药品与试剂

β-榄香烯（江苏菲亚生物科技有限公司）；阿奇霉素（苏州俞氏药业有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1一抗（BioVision CA 94043 USA）；山羊抗兔二抗（Proteintech）；Tris-base（Roche）；十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS，武汉尚宝生物科技）；蛋白Marker（Fermentas）；乙二胺四乙酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）缓冲液（pH 8.0，武汉百耐特化工有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（北京宝日医生物技术有限公司）；SYBR®Premix ExTaqTM（TliRNaseH Plus，日本Takara Bio 株式会社）；聚偏二氟乙烯膜（谷歌生物）；RIPA 强裂解液、ECL 发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA 试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.4 菌液配制

气管内接种前1天将肺炎克雷伯菌临床株接种于血琼脂平板上，置于37 ℃CO2培养箱中培养24 h。比浊法用无菌生理盐水稀释成含菌量2.4×108CFU/mL的混悬液备用。

1.5 肺炎克雷伯杆菌肺炎大鼠模型的建立

大鼠按50～100 mg/kg 经腹腔注射氯胺酮麻醉，颈部消毒、备皮后，无菌操作，暴露大鼠上段气管，用1 mL注射器穿刺入气管并滴入菌液。其中，模型组和各给药组滴入0.15 mL浓度为2.4×108CFU/mL的菌液，正常组滴入相同剂量的生理盐水。接种后立即竖立大鼠固定台，使大鼠保持直立位约20 s，以保证接种菌液因重力作用而入肺。

1.6 分组与给药

将大鼠随机分为6 组：健康对照组、肺炎模型组、β-榄香烯低剂量组、β-榄香烯中剂量组、β-榄香烯高剂量组和阿奇霉素组，每组各9 只。阿奇霉素组（45 mg/kg），β-榄香烯低、中、高剂量组（20、40、80 mg/kg），灌胃给药12 周。健康对照组给予等体积的0.5%羧甲基纤维素钠（carboxymethyl cellulose sodium，CMCNa）溶液。

1.7 方法

1.7.1 HE 染色 将各组大鼠肺组织置于4%（φ）多聚甲醛中固定72 h，随后对已固定的肺组织置于20%（φ）乙二胺四乙酸中进行脱钙处理，将样品在梯度浓度的乙醇中脱水并包埋在石蜡中。将石蜡包埋的组织切成5 μm切片，于室温下进行苏木精染色10 min，随后伊红染色2 min。使用光学显微镜观察肺组织病理学变化。

1.7.2 肺损伤评分和肺组织W/D 值检测 收集肺组织用于检测肺组织湿、干质量及肺组织病理分析。病理分析按“1.7.1”项行HE 染色后观察进行病理结果评分。肺组织病理损伤评分标准：1 级（0 分），肺泡壁完好无增厚，无炎性浸润，间质无水肿，无充血；2级（1分），肺泡内少量炎性细胞浸润，肺泡壁未见增厚；3级（2分），明显的炎性细胞浸润，间质轻微水肿；4级（3分），明显的炎性细胞浸润，间质轻微水肿；5 级（4 分），严重的炎性细胞浸润，间质中度水肿；6 级（5 分），严重的炎性细胞浸润，间质重度水肿，纤维化物质沉积，组织局灶性坏死，肺泡壁结构不完整。参照肺炎症程度的评判标准，在200 倍视野下，每张切片随机选取5 个视野进行评分并计算总积分进行分析。肺湿、干质量的测定方法：剪下肺叶，用滤纸吸干，称湿质量后置80 ℃干燥箱内烘干至恒重，计算肺组织湿/干比（W/D）。

1.7.3 RT-PCR检测凋亡标记物Caspase-3,Caspase-9,Bax/Bcl-2,Survivin的基因表达 使用TRIzol 试剂提取总RNA，超微紫外光分光光度计测定吸光度（A260/A280）。按照Super RT cDNA 试剂盒说明书合成cDNA。通过Quantifast®SYBR®GreenPCR Kit 进行PCR 反应，反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 个循环。以GAPDH为内参，用2-△△Ct方法计算。用于该反应的引物信息见表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.7.4 ELISA 法测定外周血和肺组织中炎症因子TNF-α和IL-10 的含量 取各组大鼠肺组织，滴入含有蛋白酶抑制剂的冰缓冲液，制作成匀浆液，离心收集上清液。按照ELISA 试剂盒说明书测定肺组织上清液TNF-α、IL-10 的含量，并用同样的方法测定大鼠血清TNF-α、IL-10的含量。

1.7.5 Masson 染色 取出包埋处理的各组大鼠肺组织，进行组织切片，二甲苯脱蜡，高浓度到低浓度酒精脱水，Masson胶原染色试剂染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在显微镜下观察结果。

1.7.6 Western blot 法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT 和p-AKT 蛋白表达量 各组大鼠肺组织匀浆加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA 法测定蛋白含量。SDSPAGE 凝胶电泳分离蛋白转移至PVDF 膜。4 ℃下加 入Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT 和p-AKT 一抗（1∶1 000）孵育过夜，TBST 清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入电化学发光显色液显色。以β-actin 为内参，ImageJ V1.8.0.112 软件分析各组细胞目的蛋白与Actin比值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件对所有实验数据进行统计分析，组间差异采用t检验或单因素方差分析进行检验。实验结果以均数±标准差（）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 β-榄香烯对肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺组织病理的影响

肺组织形态变化见图1。健康对照组肺脏层胸膜完整，结构正常，无水肿，无炎性细胞浸润及充血。与健康对照组比较，模型组肺脏间质水肿严重，肺泡内出现大量炎性细胞浸润和纤维素样物质沉积，组织局灶性坏死，肺泡壁明显增厚；与模型组比较，阿奇霉素组有少量炎性细胞浸润，肺间质轻微水肿，肺泡壁结构完整；与模型组比较，低剂量组肺泡内含有大量炎性细胞浸润，肺泡上皮细胞脱落，间质水肿严重，中剂量组肺泡内含大量炎性细胞，间质轻度水肿，个别区域肺泡壁增厚，高剂量组肺泡少量炎性细胞，间质轻度水肿。

图1 各组大鼠肺组织病理学变化（HE染色，200×）Figure 1 Images of HE staining showed pathological morphological changes of the lung tissues in each group (HE staining,200×)

2.2 β-榄香烯对肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺损伤评分和W/D值的影响

如表2 所示，阿奇霉素组大鼠病理评分低于模型组（P＜0.05）。此外，与模型组比较，中、高剂量组大鼠病理评分均较低（P＜0.05）。与模型组比较，阿奇霉素组肺组织W/D 显著降低（P＜0.05）；低剂量组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，中剂量组和高剂量组肺组织W/D 均显著降低（P＜0.05）。结果表明β-榄香烯能减轻肺损伤，降低肺水肿。

表2 各组大鼠肺组织损伤评分和W/D值Table 2 Lung tissue injury scores and W/D values in each group

2.3 β-榄香烯对肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺组织凋亡的影响

如图2所示，与健康对照组比较，模型组肺组织Bax/Bcl-2、caspase-9、caspase-3mRNA 和蛋白表达显著增高，SurvivinmRNA和蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阿奇霉素组肺组织Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA和蛋白表达显著降低（P＜0.05），而肺组织SurvivinmRNA和蛋白表达却显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组肺组织各基因的表达无统计学意义（P＞0.05），中剂量组和高剂量组肺组织Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA和蛋白表达均显著降低（P＜0.05），而SurvivinmRNA和蛋白表达却显著升高（P＜0.05）。

图2 各组大鼠肺组织凋亡标记物基因的表达Figure 2 Expression of apoptosis marker genes in each group

2.4 β-榄香烯对肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠炎症因子的影响

如图3所示，与健康对照组比较，模型组血清和肺组织中TNF-α、IL-10的含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，阿奇霉素组血清和肺组织中TNF-α含量显著升高（P＜0.05），IL-10含量显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，中、高剂量组血清和肺组织中TNF-α含量显著降低（P＜0.05），IL-10含量显著升高（P＜0.05）。

图3 各组大鼠血清和肺组织中TNF-α和IL-10的含量Figure 3 The level of TNF-α and IL-10 in serum and lung tissues in each group

2.5 β-榄香烯对肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺纤维化的影响

各组大鼠进行Masson 染色，如图4 所示，健康对照组未观察到明显胶原沉积，肺泡间隔正常，结构未见破坏。模型组可见胶原沉积增多，肺泡间隔增宽，结构异常缺失，许多正常肺泡结构为胶原纤维代替。低、中剂量组肺泡结构、肺泡间隔基本与模型组相似，胶原纤维较健康对照组增多，但较模型组略有减少；病变程度和范围均较模型组轻。高剂量组和阿奇霉素组肺泡结构趋于完整、肺泡间隔正常，少见胶原沉积。

图4 各组大鼠肺组织Masson染色病理学检查结果（Masson染色，200×）Figure 4 Images of Masson staining showed pathological results of lung tissue in each group(Masson,200×)

如图5 所示，从Western blot 结果中可以看出，阿奇霉素组、β-榄香烯中、高剂量组中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN 蛋白表达量较模型组降低。与健康对照组比较，模型组中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，阿奇霉素组、β-榄香烯中、高剂量组中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

图5 各组大鼠肺纤维化标记物蛋白表达Figure 5 Protein expression of pulmonary fibrosis markers in each group

2.5 β-榄香烯对ERK1/2和AKT磷酸化的影响

Western blot 检测各组大鼠p-ERK1/2 和p-AKT水平，如图6 所示，与健康对照组比较，模型组大鼠高表达p-ERK1/2 和p-AKT 蛋白。与模型组比较，β-榄香烯低剂量组p-ERK1/2 和p-AKT 蛋白表达无明显差异，β-榄香烯中、高剂量组和阿奇霉素组p-ERK1/2和p-AKT蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。

图6 各组大鼠ERK1/2和AKT的磷酸化情况Figure 6 Phosphorylation levels of ERK1/2 and AKT in each group

3 讨论

肺炎是败血症最常见的病因，肺炎克雷伯菌是肺炎和败血症的常见病原体[6-7]。抗生素通常用于肺炎克雷伯菌感染的治疗，其中碳青霉烯类药物被认为是广泛用作肺炎克雷伯菌引起的严重感染的首选药物，尤其是产生β-内酰胺酶的菌株[8]。然而，由于克雷伯菌具有多重耐药机制，目前治疗方法的疗效不断下降，一些肺炎克雷伯菌对抗生素具有高度耐药性[9]。因此，探寻新的能够治疗肺炎克雷伯菌感染的高效、安全的药物是临床治疗克雷伯菌急性肺炎的重要环节。

在细菌性肺炎模型中，肺组织产生大量炎症因子，加重体内炎症反应。研究表明，β-榄香烯在多种炎性疾病和癌症中发挥调控作用，如β-榄香烯通过下调缺氧诱导因子（HIF-1α）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血管内皮生长因子（VEGF）表达水平保护STZ 诱导的糖尿病大鼠肺损伤，β-榄香烯通过降低细胞增殖、代谢和侵袭能力抑制多种癌细胞的恶性生物学行为[10-12]。本研究发现β-榄香烯能明显改善克雷伯菌急性肺炎大鼠肺组织病理损伤，降低肺组织的W/D 值，提示β-榄香烯可减轻肺炎克雷伯菌引起的肺损伤。

β-榄香烯可激活Caspase-3、7、9 和10，以及对Bcl-2 蛋白家族的影响引发凋亡性细胞死亡[13-14]。Zhang 等[15]报道称，β-榄香烯可抑制Survivin表达以及Survivin与乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白相互作用蛋白之间的相互作用，研究还发现β-榄香烯在体外促进神经胶质瘤细胞的凋亡。而本研究发现β-榄香烯抑制Caspase-3和Caspase-9表达，促进Bcl-2/Bax和Survivin的表达。这可能与β-榄香烯对不同疾病所起作用存在差异有关，其有待进一步研究。

肺炎克雷伯菌感染可引起炎症细胞流入肺实质，并伴有促炎细胞因子和化学因子的释放，造成中性粒细胞聚集[16-17]。Fang 等[18]发现在RAW264.7 巨噬细胞系中β-榄香烯能明显抑制脂多糖诱导的促炎性介质，包括IL-6、TNF-α和IL-1β的产生。此外，β-榄香烯抑制脂多糖诱导的RAW264.7 巨噬细胞中iNOS 和IL-10 的表达，β-榄香烯的抗炎作用与其对Wnt/β-连环蛋白信号通路的调节密切相关[18]。本研究发现，β-榄香烯能抑制外周血和肺组织中的TNFα水平，提高IL-10 水平。TNF-α可以通过T 细胞促进各种炎症细胞因子的产生，从而促进炎症反应的发生。抗炎性细胞因子IL-10 抑制单核巨噬细胞释放炎症介质，增强抗炎性因子释放，抑制炎症反应的发生。本研究结果表明β-榄香烯针对克雷伯菌急性肺炎具有潜在的抗炎作用。

在肺纤维化中，正常的肺组织结构被瘢痕组织所取代，瘢痕组织通常以胶原沉积和成纤维细胞增殖为特征。本研究采用Masson 染色发现β-榄香烯使成纤维细胞数量减少，肺间质区细胞外基质过度沉积得以缓解。TGF-β1 是主要的促纤维化细胞因子之一，在肺纤维化的发病机制中起着重要作用。而在肺纤维化过程中，成纤维细胞被激活并转化为肌成纤维细胞，其中α-SMA 表达和细胞外基质ECM 蛋白沉积，被认为是肌成纤维细胞的标志物[19]。本研究发现β-榄香烯可显著降低TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN 蛋白表达水平，表明β-榄香烯可以减轻肺纤维化。

肺纤维化与细胞因子和激酶激活肺组织纤维化信号通路有关，其中ERK1/2 是细胞表面到细胞内部信号转导的重要递质。ERK1/2 是成纤维细胞增殖和分化信号传导的共同途径，也是成纤维细胞向核内多次信号转导的共同途径。ERK1/2/AKT 信号传导通路在肺纤维化中细胞增殖、分化、新陈代谢及凋亡过程中有着重要作用，ERK1/2/AKT 蛋白过表达，促进肺间质纤维化生物学行为[20-21]。本研究发现β-榄香烯显著降低ERK1/2 和AKT的磷酸化水平，表明β-榄香烯可能通过ERK1/2 和AKT 信号通路抑制肺成纤维细胞分化。

综上所述，本研究通过克雷伯菌建立大鼠急性肺炎模型，观察到β-榄香烯能抑制ERK1/2 和AKT的磷酸化，表明β-榄香烯对克雷伯菌急性肺炎具有抗炎作用，能降低炎症因子水平，使肺纤维化程度得以减轻，为β-榄香烯应用于急性肺炎的临床防治提供了理论依据。