芪斛楂颗粒不同部位对小鼠巨噬细胞增殖和吞噬活性及细胞周期的影响*

黄甫静，张金娟，冯敏，廖尚高，何迅

(1.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州医科大学 基础医学院，贵州 贵阳 550025；3.葵花药业集团贵州宏奇有限公司，贵州 六盘水 553400；4.贵州医科大学 医药卫生管理学院，贵州 贵阳 550025)

芪斛楂颗粒是由黄芪、山药、炙甘草、石斛、茯苓、炒麦芽、山楂、木瓜、党参、陈皮及白术11味药味组成的中药复方制剂，临床上用于脾失健运引起的易感冒、厌食及便溏等症的治疗，疗效确切[1]。研究表明，脾虚与机体的免疫功能密切相关，免疫系统的运转又与巨噬细胞的功能密切相关[3]，诸多关于脾虚证的研究将巨噬细胞作为了研究对象[2-4]。已有研究表明，组成芪斛楂颗粒制全方的11味药均具有免疫调节方面的活性[4-14]，其中黄芪、甘草、茯苓、党参及白术还可通过促进巨噬细胞增殖、增强其吞噬活性，从而发挥免疫调节作用[15-19]。芪斛楂颗粒组分众多、成分复杂，其发挥作用的活性部位目前尚不清楚，探讨其活性部位有利于提高该制剂的质量控制水平和进一步的应用推广[20]。本研究按照极性差异将芪斛楂颗粒分成4个不同部位，以小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7为对象，考察芪斛楂颗粒不同部位对巨噬细胞的影响，为评价芪斛楂颗粒的免疫调节活性及活性部位奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1细胞 小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2主要药品和试剂 芪斛楂颗粒浸膏(葵花集团贵州宏奇有限公司)，磷酸盐(phosphate buffer saline，PBS)缓冲液(PBS粉末自配，pH 7.2～7.4，质量浓度11.74 mg/L；无锡傲锐东源)，伯克改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)和0.25%胰蛋白酶(美国Gibco)，胎牛血清(美国ScienCell)，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，细胞培养级)，四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)试剂、脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)及中性红染料(北京索莱宝)，细胞周期检测试剂盒(江苏凯基)。

1.1.3主要仪器 SG8200HE型超声波提取器(上海冠特)，TB-2150D型梅特勒-托利多十万分之一天平(北京赛多利斯)，CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher Scientific)，酶标仪(美国Bio-Tek)，Primo Vert型倒置显微镜(成贯仪器)，SW-CJ-2D型超净工作台(苏州净化设备),NoveCyte流式细胞仪(美国艾森生物)。

1.2 研究方法

1.2.1芪斛楂颗粒不同部位的制备 取斛楂颗粒浸膏100 g，加水500 mL溶解，加95%乙醇使含醇量为80%，搅拌均匀，静置12 h，抽滤、收集沉淀物，按savage试剂 ∶粗多糖溶液=1 ∶5加savage试剂，充分搅拌1 h，8 000 r/min离心 10 min，取上清液，弃滤渣，重复操作5～6次，取上清液减压浓缩，冷冻干燥后即得多糖，为A部位(fraction A，Fr.A)；在多糖样品中滤出沉淀物(多糖)后，收集滤液，减压浓缩得浸膏，冷冻干燥，得非多糖浸膏备用；湿法上大孔树脂D101柱，以水、75%乙醇和95%乙醇梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，分别得水洗脱部位(fraction B，Fr.B)、75%乙醇洗脱部位(fraction C，Fr.C)及95%乙醇洗脱部位(fraction D，Fr.D)。

1.2.2RAW264.7细胞的培养 RAW264.7细胞使用含有10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每24 h换液1次，每2～3 d传代1次，取对数生长期细胞用于后续试验。

1.2.3芪斛楂颗粒不同部位对RAW264.7细胞增殖活性的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，以1×108个/L的密度按100 μL/孔接种于96孔细胞培养板中，培养24 h；吸弃原培养基，加7.81、15.73、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00及1 000.00 mg/L芪斛楂颗粒Fr.A、Fr.B、Fr.C及Fr.D，空白组加不含药物的完全培养基，每组设6个复孔；药物作用24 h ，每孔分别避光加5%MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，吸尽孔中溶液，每孔加DMSO 150 μL摇床振荡10 min。酶标仪上测定490 nm 波长处的吸光度(optical density，OD)，计算细胞增殖率[细胞增殖率(%)=OD处理组/OD空白组×100%]。

1.2.4芪斛楂颗粒Fr.A部位对RAW264.7细胞吞噬活性的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，以1×108个/L密度按100 μL/孔接种于96孔细胞培养板，培养24 h，将RAW264.7细胞随机分为空白组(不含药物的完全培养基)、LPS组(5.00 mg/L)及Fr.A组[低(30.00 mg/L)、中(60.00 mg/L)及高剂量组(120.00 mg/L)]，按分组情况给药，空白组给予等体积的完全培养基，每组设6个复孔；培养24 h，吸弃上清，每孔加中性红试剂200 μL，培养2 h，PBS洗涤3遍，加乙酸-乙醇溶液(50%乙醇、1%乙酸及49%水，200 μL/孔)，常温振摇15 min，于540 nm处测定OD值，并计算中性红吞噬率[中性红吞噬率(%)=OD处理组/OD空白组×100%]。

1.2.5芪斛楂颗粒Fr.A部位对RAW264.7细胞增殖周期的影响 取对数生长期的RAW264.7细胞，以1×109个/L的密度按2 mL/孔接种于6孔细胞培养板，培养24 h，按“1.2.4”项下分组情况设置各试验组，每组设3个复孔，培养24 h，预冷PBS洗涤1遍，0.25%胰酶消化，1 000 r/min 离心5 min，收集细胞；预冷PBS洗涤3遍，加预冷70%乙醇500 μL，4 ℃固定过夜，1 000 r/min 离心3 min；预冷的PBS洗涤3遍，弃上清，加PI/RNase(PI ∶RNase=9 ∶1)工作液500 μL，室内避光放置60 min，用流式细胞仪检测各组细胞的周期变化，每组重复3次实验，计算染色平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 细胞增殖活性

与空白组相比，质量浓度15.73～1 000.00 mg/L Fr.A和Fr.C组RAW264.7细胞的增殖率上升(P<0.05或P<0.01)，质量浓度500.00～1 000.00 mg/L Fr.B组RAW264.7细胞的增殖率明显增加(P<0.01)，质量浓度7.81～1 000.00 mg/L Fr.D组RAW264.7细胞的增殖率无明显变化(P>0.05)。见图1。

注：A～D分别为芪斛楂颗粒Fr.A、Fr.B、Fr.C及Fr.D部位；与空白组比较，(1)P<0.05,(2)P<0.01。图1 芪斛楂颗粒不同部位对RAW264.7细胞增殖活性的影响Fig.1 Effects of different fractions of qihuzha granule on RAW264.7 cell proliferation

2.2 Fr.A部位对RAW264.7 细胞吞噬活性的影响

结果显示，与空白组相比，LPS组RAW264.7细胞的中性红吞噬率明显上升(P<0.01)，低、中、高剂量Fr.A组RAW264.7细胞的中性红吞噬率随药物质量浓度的增大而增加，差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见图2。

注：与空白组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01。图2 芪斛楂颗粒Fr.A部位对RAW264.7细胞吞噬活性的影响Fig.2 Effects of Fr.A of qihuzha granule on phagocytic activity of RAW264.7 cells

2.3 Fr.A部位对RAW264.7 细胞增殖周期的影响

结果显示，与空白组比较，LPS组和中、高剂量Fr.A组RAW264.7细胞在G0/G1期的细胞比例上升、G2/M期的细胞比例降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，S期的细胞比例无变化(P>0.05)。见图3。

注：A～E分别为空白组、LPS组、低剂量Fr.A组、中剂量Fr.A组及高剂量Fr.A组的流式细胞仪检测结果，F为各组细胞周期定量结果；与空白组比较，(1)P<0.01,(2)P<0.05。图3 各组RAW264.7细胞的增殖周期Fig.3 Cell cycles of RAW264.7 cells in each group

3 讨论

芪斛楂颗粒对小儿脾胃气虚引起的相关临床症状有良好的治疗作用，“脾为之卫”，对机体免疫系统的维持被认为是脾脏的重要功能之一，脾虚时机体的免疫功能受到抑制[21]。在细胞层面表现为巨噬细胞的活性减弱、增殖受到抑制、吞噬功能显著下降，自然杀伤细胞的活性降低，T细胞和B细胞等淋巴细胞的增殖活性受到抑制等方面的改变[22-23]。有研究认为，巨噬细胞的功能下降是脾虚证免疫功能失调的重要机制之一[24]。巨噬细胞是皮肤黏膜屏障之后抵抗病原微生物入侵的第一道防线，对天然免疫和获得性免疫均有重要影响，在免疫系统中占据了重要地位[25]。研究表明，巨噬细胞的功能改变会导致机体的免疫稳态遭到破坏[26]；马海航等[27]研究表明巨噬细胞的数量变化和活化与机体免疫功能改变密切相关。本研究考察了芪斛楂颗粒不同部位对巨噬细胞的影响，结果显示，芪斛楂颗粒的Fr.A、Fr.B及Fr.C部位均对RAW264.7细胞的增殖活性有促进作用，而Fr.D部位对该细胞的增殖无影响，提示芪斛楂颗粒中极性中等和极性偏大的成分能够促进RAW264.7细胞增殖，小极性成分则不影响该细胞的增殖；在具有促进细胞增殖活性的3个部位中，Fr.A部位的作用最强，提示Fr.A为其主要活性部位，故而采用Fr.A部位进行后续研究。

巨噬细胞的吞噬功能使其具有清除自身衰老细胞、杀灭外源性抗原及抗原提呈等的作用，是检验其细胞功能强弱的重要指标[28]。本研究的中性红吞噬试验结果显示，Fr.A部位可以显著提高RAW264.7细胞吞噬中性红染料的的能力，对其吞噬活性具有良好的促进作用。

细胞周期是指细胞分裂结束到下一次分裂结束所经历的过程，其基本流程为：G0/G1→S→G2→M，处于不同周期的细胞，其内部的DNA含量具有较大的差异[29]。对细胞周期进行检测，可以反映出各周期阶段的细胞比例，从而观察药物对细胞增殖的影响[30]。本研究结果显示，Fr.A部位可以使处于G0/G1期的巨噬细胞比例增多，且其作用强度随药物质量浓度的加大而增强，提示Fr.A部位可通过增加处于分裂初期或具有分裂潜质阶段的细胞比例而加速巨噬细胞的增殖。

综上所述，本研究初步探讨了芪斛楂颗粒不同极性部位对RAW264.7巨噬细胞的影响，发现芪斛楂颗粒中Fr.A、Fr.B及Fr.C部位均能促进RAW264.7细胞增殖，其中Fr.A部位活性最强可增强RAW264.7细胞的吞噬活性，并增加处于G0/G1期的巨噬细胞比例，提示Fr.A部位可能是芪斛楂颗粒改善脾虚证相关症状的主要活性部位。