氯化苦和棉隆对草莓土壤养分、病原菌及微生物群落的影响

李青杰，张大琪，任立瑞，颜冬冬，李 园，王秋霞，曹坳程

(中国农业科学院 植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

草莓（Fragaria×ananassaDuch.） 是多年生草本植物，具有丰富的营养价值，是我国重要的园艺作物［1］。据统计，2018 年中国草莓种植面积为11.11 万hm2，占全世界的29.8%，是世界上草莓种植面积最大的国家［2］。但近年来，由于草莓经济价值的增长和耕地数量的限制，草莓连作现象十分普遍［3］。连作导致土壤中积累了大量的病原菌和虫卵，进而引发土传病害，造成草莓的产量和品质大幅度下降，严重制约了草莓的生产和发展［4］。目前主要用氯化苦和棉隆对草莓连作土壤进行熏蒸处理，防治土传病害，从而提高草莓产量［5］。

氯化苦和棉隆用途广泛，可用于连作地块土传病害的防治，已在三七、草莓、生姜等作物上表现出优异的防治效果［6］。Harris［7］研究表明氯化苦和棉隆熏蒸可有效减少土壤中线虫的数量，显著增加草莓产量。但前期研究表明氯化苦对土壤的负面影响较大。范琳娟等［8］研究发现与棉隆相比，氯化苦对土壤养分、微生物数量及酶活性有较强的抑制作用。杨叶青等［9］研究表明棉隆处理草莓连作土壤，可使食细菌的真头叶属线虫总丰度增加42.03%，且对有害线虫的抑制作用大于氯化苦，推荐使用棉隆。

化学熏蒸剂具有广谱性，氯化苦和棉隆熏蒸在杀死病原物的同时，对土壤微生物也造成了不利影响［10］。土壤微生物参与有机质的分解、养分的转化与循坏、腐殖质的形成等过程，是土壤生态系统的重要组成部分，它们还常被用来评价土壤微生态的健康状况［11］。一些微生物如芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和毛壳菌属（Chaetomium）还可以作为生物防治剂防治土传病害［12］。研究土壤微生物群落的变化可以更深入的表征熏蒸处理对微生态的影响。同时，土壤微生物群落的变化会影响土壤中养分的转化，其和土壤中病原菌的数量也密切相关［13］，因此研究土壤微生物时，表明土壤养分和土壤病原菌的变化会更直观、更易理解。目前氯化苦和棉隆熏蒸对草莓连作土壤的研究多集中在土壤肥力、酶活性、微生物数量以及线虫防治等方面，还没有关于其对河北省草莓连作土壤微生物群落影响的公开报道。

本研究以河北省保定市满城区李家佐村草莓连作20 年以上的土壤为研究对象，分别进行氯化苦和棉隆熏蒸，在草莓缓苗期和采摘期收集土壤样品分析土壤理化性质、土壤病原菌以及细菌群落的变化，以期为河北省草莓生产上棉隆和氯化苦的合理使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2019 年7 月— 2020 年4 月在河北省保定市满城区李家佐村（GPS 坐标：38°59′20.6"N，115°16′00.8"E）温室大棚内进行，该大棚连续种植草莓20 年以上且病虫害发生严重。供试土壤为粉质壤土，其基本理化性质为铵态氮14.68 mg/kg、硝态氮15.64 mg/kg、有效磷248.63 mg/kg、速效钾349.64 mg/kg、有机质15.98 g/kg、pH 为7.58。

1.2 供试材料

供试草莓品种：′丹莓1 号′，供试药剂：99%的氯化苦原液（辽宁大连绿峰化学股份有限公司）；98%的棉隆微粒剂（江苏南通施壮化工有限公司）。

1.3 试验设计

熏蒸试验于2019 年7 月7 日在试验大棚内进行，共设置3 个处理：（1）CK：不做任何处理；（2）Pic：用99% 的氯化苦原液进行熏蒸；（3）DZ：用98%的棉隆微粒剂进行熏蒸。氯化苦和棉隆的施用剂量均为30 g/m2，每个处理小区34 m2，每个处理3 个重复。熏蒸完成后，立即覆盖0.04 mm 的聚氯乙烯膜（PE），1 个月后揭开PE 膜进行敞气20 d左右，移栽长势一致、生长健壮的草莓苗种植，其他田间管理措施均一致。土壤样品采集于草莓缓苗期（2019 年9 月5 日）和采摘期（2019 年12 月30 日），采用五点取样法在每个处理小区内随机选取3 个点采集5 ～20 cm 的土壤，取回的土样均过2 mm 筛，进行后续理化性质、病原菌、微生物的测定。

1.4 测定指标及方法

土壤养分依据鲍士旦［14］的方法进行测定：土壤铵态氮和硝态氮的含量用KCl 浸提后上流动分析仪进行检测，有效磷的含量用NaHCO3浸提后用分光光度计检测，速效钾的含量用CH3COONH4浸提后采用火焰分光光度计检测，有机质采用氧化还原法经高温消煮后进行滴定，pH 和电导率分别用pH计和电导率仪进行测定（土∶水=1 ∶2.5）。

土壤病原菌：分别采用Komada 培养基［15］和Masago 培养基［16］分离测定土壤中的镰刀菌属（Fusariumspp.）和疫霉属（Phytophthoraspp.）。

土壤细菌群落：取0.25 g 充分混匀的草莓采摘期土样， 采用Powersoil®DNA 提取试剂盒（Mo Bio, Carlsbad, USA） 提取土壤微生物中总的基因组DNA，使用细菌通用引物338F（5′- ACTCCTACGGGAGCAGCAG-3′）-806R(5′-GGACTACHGGGTWTCTAAT-3′) 扩增土壤细菌微生物的16SrRNA 基因V3-V4 区域。PCR 扩增及测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成。之后按照美吉公司提供的标准方法，在Illumina MiSeq 平台（Illumina，San Diego，USA）上将原始数据进行质量过滤和合并后，在97%的相似水平下进行聚类、获得 OTU。所有样本均根据最小样本序列数进行2次采样，用于分析细菌群落多样性、群落组成的变化。

1.5 数据处理

病原菌抑制率%=（对照处理的菌落数-熏蒸处理的菌落数）/对照处理的菌落数×100%

采用Microsoft Excel 2010 软件处理试验数据，SPSS 20.0 软件采用单因素方差分析（ANOVA）和Duncan 氏新复极差法进行差异显著性检验(P=0.05)，用Origin 2017 软件进行图表的制作。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤养分的影响

2.1.1 不同处理对土壤氮素的影响 由图1 可知，与对照相比，氯化苦和棉隆处理后草莓缓苗期的土壤铵态氮含量分别显著增加了25.51、45.78 倍；土壤硝态氮含量分别显著降低了96.19%、94.05%。草莓缓苗期氯化苦处理的铵态氮含量显著低于棉隆处理组，二者之间的硝态氮含量无显著差异。草莓采摘期时熏蒸处理的土壤铵态氮和硝态氮含量均与对照无显著差异。说明氯化苦和棉隆熏蒸前期均会抑制硝化作用，后期对硝化作用的抑制减弱。

图1 不同处理下土壤各阶段铵态氮和硝态氮的含量变化Fig. 1 Changes in the contents of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in various stages of soil under different treatments

2.1.2 不同处理对土壤理化性质的影响 由表1 可知，与对照相比，氯化苦和棉隆处理后草莓缓苗期有效磷含量分别显著降低了9.73%、20.97%，在草莓采摘期时棉隆处理的有机质含量显著提高，其他处理间无显著差异。草莓缓苗期时氯化苦和棉隆处理的速效钾含量分别显著增加了51.67%、42.93%，电导率分别显著增加了47.54%、40.98%，在草莓采摘期未表现出显著差异。草莓缓苗期和采摘期时氯化苦处理的pH 均比对照显著降低1.75%～2.61%，棉隆处理的pH 和对照间则无显著差异（P＞0.05）。

表1 不同处理下土壤各阶段理化性质的变化Table 1 Changes in physical and chemical properties of soil at various stages under different treatments

2.2 不同处理对土壤病原菌的影响

由表2 可知，氯化苦和棉隆处理在草莓缓苗期和采摘期对镰刀菌属的抑制率均在90%以上，而对疫霉属的抑制率均在80%以上。说明氯化苦和棉隆熏蒸处理均可有效防治镰刀菌属和疫霉属，但对镰刀菌属的防治效果更好。草莓采摘期时棉隆对病原菌表现出更优异的防治效果，其对病原菌的抑制率高于氯化苦处理。

表2 不同处理下土壤各阶段病原菌抑制率的变化Table 2 Changes in the inhibition rate of pathogens in different soil stages under different treatments

2.3 不同处理对土壤细菌群落的影响

2.3.1 不同处理对细菌群落Alpha 多样性指数的影响 由表3 可知，氯化苦和棉隆处理后，Shannon 指数分别比对照降低0.90%、0.74%，Simpson 指数分别比对照增加14.29%、32.14%。说明熏蒸处理均降低了细菌群落的多样性。与对照相比，氯化苦处理的ACE和Chao1 指数分别比对照增加了1.46%、2.15%，棉隆处理的ACE和Chao1指数分别比对照降低了1.43%、1.19%。说明氯化苦处理增加了细菌的物种丰富度，棉隆处理降低了细菌的物种丰富度。

表3 不同处理下细菌群落的Alpha 多样性指数变化Table 3 Changes of Alpha diversity index of bacterial community under different treatments

2.3.2 不同处理对细菌群落的层级聚类影响 由图2 可知，每个处理的3 个重复聚类在一起，说明本次测序的样本重复性较好。棉隆处理和对照间相距较近，氯化苦处理则和对照间相距较远，说明草莓采摘期时棉隆熏蒸对细菌群落的影响较氯化苦的影响小。

图2 不同处理样品的细菌层级聚类图Fig.2 Bacteria hierarchical clustering diagram of different processed samples

2.3.3 不同处理对细菌群落门水平物种的影响 在门水平上使用单因素对样本中相对丰度排名前10的物种进行差异性分析。由图3 可知，所有样本中的优势细菌门均为变形菌门（Proteobacteria），占30.39%～38.79%。氯化苦和棉隆处理后变形菌门的相对丰度分别降低了21.66%、17.66%，酸杆菌门（Acidobacteria）的相对丰度分别降低了21.18%、37.37%，但和对照间无显著性差异。与对照相比，氯化苦和棉隆处理后疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度分别显著增加了106.61%、56.31%。与氯化苦熏蒸相比，棉隆熏蒸还增加了绿弯菌门（Chloroflexi）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度。

图3 不同处理样品的细菌门水平上群落组成差异图Fig.3 Diagram of community composition differences at the bacterial phyla level of different processed samples

2.3.4 不同处理对细菌群落属水平物种的影响 在属水平上使用单因素对样本中相对丰度排名前10 的物种进行差异性分析。由图4 可知，对照组、氯化苦和棉隆处理的优势细菌属分别是是鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和小单孢菌属（Micromonospora）。与对照相比，氯化苦和棉隆处理后小单孢菌属的相对丰度分别显著增加了1.76、2.96 倍，马杜拉放线菌属（Actinomadura）的相对丰度分别显著增加了9.37、2.30 倍；鞘氨醇单胞菌属的相对丰度分别显著降低了0.38、0.60 倍，东属（Dongia）相对丰度分别显著降低了0.61、0.68倍。由此可知，氯化苦和棉隆熏蒸处理对细菌群落属水平的影响更显著。

图4 不同处理样品的细菌属水平上群落组成差异图Fig.4 Diagram of community composition differences at the level of bacterial genus of different processed samples

3 讨论与结论

土壤熏蒸会影响土壤的养分循坏过程，进而影响土壤的氮素转换［17］。氯化苦和棉隆熏蒸前期均抑制硝化作用，在草莓采摘期时抑制作用减弱，恢复至对照水平。这与方文生［18］的研究结果土壤熏蒸对硝化作用的抑制效果会随着时间的延长减弱一致。氯化苦和棉隆熏蒸在草莓缓苗期均降低了有效磷含量和电导率、增加了速效钾含量，但在草莓采摘期时与对照间无显著差异。说明熏蒸后期对有效磷、电导率以及速效钾的影响较小。熏蒸处理后草莓采摘期的土壤有机质含量显著增加，可能是熏蒸杀死了部分土壤微生物，其体内的物质及有机质释放到土壤中提高了有机质的含量［19］。熏蒸处理在草莓整个生长期均降低pH，改善了土壤酸碱度，有利于草莓生长，这与张大琪等［20］的研究结果一致。

连作地块的土壤中含有大量的病原菌，土壤熏蒸可杀灭多数病原菌，有效防治土壤病原真菌镰刀菌和疫霉菌［21］。运翠霞等［22］研究表明棉隆与氯化苦熏蒸显著减少了土壤中镰刀菌和疫霉菌的数量，对土传病原菌的抑制率均在95%以上。Cheng 等［23］研究表明1,3-二氯丙烯熏蒸可显著降低土传病原菌的数量，促进番茄生长，增加番茄的产量。试验表明氯化苦和棉隆熏蒸均可有效防治镰刀菌属和疫霉菌属，但在草莓采摘期棉隆熏蒸对病原菌的抑制率更高。这与Zhang 等［4］的研究熏蒸可减少镰刀菌和疫霉菌的数量，防治土传病害的结果一致。

土壤微生物是维持土壤生态系统稳定的关键因素，有益微生物数量的增加对土壤微生态动态平衡的维持至关重要［24］。本试验表明，氯化苦和棉隆熏蒸均降低了土壤细菌群落的多样性，这与刘珊珊等［25］的研究结果一致。层级聚类分析表明棉隆熏蒸对土壤细菌群落的影响较小。熏蒸处理的土壤细菌群落在门、属水平上和对照间存在显著差异。其中，氯化苦和棉隆熏蒸增加了有益微生物如放线菌门和芽孢杆菌属的相对丰度。放线菌门和芽孢杆菌属常在健康的土壤中发现，可以促进土壤的养分循坏,对维持土壤微生态的动态平衡至关重要［26］。试验表明氯化苦和棉隆熏蒸增加了芽孢杆菌属的相对丰度，可能和降低镰刀菌、疫霉菌的数量有关。

本试验表明氯化苦和棉隆熏蒸可有效防治土传病原菌，改善土壤的酸碱度和养分含量。但两者对土壤微生物的影响程度不同。与氯化苦熏蒸相比，棉隆熏蒸对土壤养分和细菌群落的影响较小，在草莓采摘期时可恢复至和对照相似的水平。因此在草莓连作地块，可以选用棉隆进行土壤熏蒸，在有效防治土传病害的同时对土壤的负面影响也较小。