有机耕作对冬小麦品质及根际微生物群落结构和多样性的影响

田 硕，胡 栋，马 佳，彭杰丽，王 旭，魏晓艳，王占武

(1. 河北省农林科学院 农业资源环境研究所/河北省肥料技术创新中心，河北 石家庄 050051;2. 河北师范大学 生命科学学院, 河北 石家庄 050024）

自20 世纪中期人工合成的肥料、农药等面世以来，世界范围的农作物产量大幅度提升，对缓解全球食物危机做出了重要贡献，但同时也对气候、环境和食品安全等带来负面影响，土壤理化性质、结构和功能逐渐退化［1］。为此，从20 世纪90 年代开始，一种环境友好型的耕作方式——有机农业在欧洲兴起，栽培面积以每年10%左右的速度递增，欧美国家的有机农业栽培面积占耕地面积的5%～10%［2］。有机农业是将保护性耕作和现代耕作技术相结合的栽培系统，其主要措施是不使用化学合成的肥料、农药和转基因种子，采用种养循环、轮作栽培、绿肥还田、天敌释放、人工除草等自然措施为植物提供养分，防控病虫危害［3］，因此，与传统农业相比，有机农业大幅度减少外源物质向农业生产系统的投入，减少了能源和矿物的消耗，更符合自然物能循环规律，大量研究发现，采用有机生产方式，对改善农田生物多样性，减少温室气体（GHG）排放，缓解土壤富营养化等效果显著［4］。

微生物是土壤生态构成中最重要的组成部分，在土壤物理结构变化、陆地养分循环、碳素固定、生物多样性调控等方面起着关键和不可替代的作用［5］。前人研究发现，土壤微生物是评价土壤质量、农田管理以及作物产量的重要指标，微生物的多样性与土壤肥力及作物生产力呈显著正相关［6-8］。根际微生物则直接作用于植物的生长，起着养分供应、健康保育作用，与农产品质量和风味等有直接关系［9］。目前，关于有机耕作方式对土壤的影响研究以设施栽培较多，且多关注于土壤理化性质方面［10-12］，关于大田作物，特别是多年种植冬小麦根际微生物群落结构、功能多样性的研究还鲜有报道。基于此，本研究以位于河北省邢台市宁晋县凤归巢公司的有机小麦生产基地为例进行定位研究。该基地的有机小麦耕作面积约250 hm2，于2014 年开始进行有机转换，2017 年通过有机认证。2019 年即第5 个耕作年进行采样，检测小麦产量、品质和土壤理化性质变化，采用第二代高通量测序技术检测冬小麦根际微生物多样性和菌群丰度，以常规耕作为对照。通过数据分析，揭示有机耕作对小麦产量、品质和根际微生物群落结构的影响，为指导农田地力改善和持续利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

研究样地位于河北省邢台市宁晋县北河庄镇，属于华北平原地区，处于暖温带亚湿润季风气候区，年降水量501 mm，年平均气温13 ℃，土壤为沙壤壤质。该基地为凤归巢公司的有机农业生产基地，其中农作物耕作面积250 hm2，均采用冬小麦—夏玉米轮作方式，另建有有机食用菌生产厂和食品加工厂。

1.2 试验设计

试验区选择3 个样地，地理位置分别位于宁晋县北河庄一村（37°34′53"E,114°52′ 10"N）、北河庄二村（37°33′ 40"E,114°52′ 30"N）和东沙良村（37°33′ 53"E,114°52′ 33"N），每个地块均设有有机和常规耕作区。有机耕作全部按国家标准GB/T19630.1—2011 进行，自2014 年历经3年的有机转换期，2017 年通过有机认证，之后进入正式生产期。试验用小麦播种量225 kg/hm2，10 月12 日播种，采用喷灌方式浇水。

1.3 试验操作

有机耕作区采用秸秆全量还田方法，使用自制堆肥和酵素等循环方式，提供植物养分。采用轮作倒茬、抗病品种和天敌培养等措施防控病虫害，采用人工除草。常规耕作秸秆全量还田，底肥施用氮磷钾复混肥，4 月中旬返青期追施氮钾复混肥，喷施除草剂和杀虫剂，农资材料从当地市场购买。具体措施和用量见表1。

表1 采取的主要耕作措施Table 1 Main cultivation methods

1.4 样品采集和分析方法

2020 年4 月8 日—6 月15 日期间，于小麦返青期、抽穗期和成熟期，采集小麦根际土壤样品检测微生物多样性和丰富度，将小麦植株带土整株挖出，挖深20 cm，将根部大块土壤抖落以后，将附着在小麦根部的土用灭菌刷子轻轻扫下，收集到灭菌的EP 管中，置于便携式低温保存箱中，2 h 内带回实验室，保存到-80 °C 冰箱中备用，用于土壤根际微生物DNA 提取。在成熟期，每个地块随机选取1 m2小麦5 个，全部收割后放入种子网带，风干后测产，收获的小麦籽粒用于品质测定。在成熟期，采用“田”字九点取样法，采集0 ～20 cm 土壤样品用于土壤理化性质的测定，各取样点的间隔不小于10 m。

小麦籽粒品质检测按GB5506—85 国标法进行。微量元素、重金属含量用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定［13］。根际土壤微生物总DNA 用MP Biomedicals 公 司 的Fast DNATMSpin Kit For Soil 试剂盒提取，用Nano Drop 2000测定DNA 浓度和纯度， 合格的DNA 样品采用Illumina 二代高通量测序方法测序。细菌检测16S rRNA V3 ～V4 区基因，测序引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) 和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)， 真菌检测18S rRNA ITS1 区基因， 测序引物为ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′) 和2043R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)，PCR 产物混样后进行过柱纯化，用1.8%的琼脂糖凝胶进行DNA片段回收，最后进行上机测序。

1.5 数据分析

采用Spss.20 进行方差分析（LSD 法），微生物多样性分析在百迈克云平台进行，用Mothur versionv.1.30 进行Alpha 指数分析。土壤理化因子与小麦根际微生物组成相关性（RDA）的Beta 多样性分析在R 语言平台绘制。用Graph pad prism 5 制作图表。

2 结果与分析

2.1 有机耕作5 年冬小麦的产量和品质特征

测产表明，有机和常规耕作小麦产量分别为6 300 和6 943 kg/hm2，有机耕作比常规耕作低9.26%。从籽粒品质检测结果看（表2），有机耕作小麦的粗蛋白含量、沉淀指数、稳定时间和湿面筋含量均略低于常规小麦，分别降低了7.03%、3.25%、6.67%和5.43%，但最大拉伸阻力较常规小麦提高了12.14%，说明在有机耕作下小麦的筋力有所增强。在矿质元素方面（表3），有机小麦籽粒Zn、Se、Mg 的含量显著高于常规小麦（P＜0.05），分别提高了11.79%、8.3% 和2.06%，而重金属Cr、Pb、As 含量显著低于常规小麦（P＜0.05），分别降低了39.52%、26.08%和2.8%。有机耕作小麦的加工品质改善，微量元素含量提高，重金属含量显著下降。

表2 小麦籽粒品质分析Table 2 Wheat grain quality

表3 小麦籽粒矿质元素含量Table 3 Content of mineral elements in wheat grain

2.2 小麦土壤理化性状的变化

在小麦成熟期，检测了0 ～20 cm 耕层土壤的理化性状，结果见表4。与常规耕作比较，有机耕作土壤有机质、全氮、碱解氮都有所升高，分别提高了11.80%、8.78%、10.05%，电导率下降了18.97%，pH 升高了0.31 个pH 单位，速效磷含量下降幅度较大，降低了67.6%，硫降低了6.61%。可见，尽管有机耕作投入的氮素养分并不高于常规耕作，但土壤全氮、碱解氮的含量水平却提高了，具体机制待研究。此外，表征土壤盐分的电导率下降，pH值升高，说明土壤理化性状得到了改善。

表4 成熟期小麦土壤理化性状Table 4 Soil physical and chemical properties in wheat maturity stage

2.3 有机耕作5 年小麦根际微生物Alpha 多样性特征

对小麦根际细菌16S rRNA 基因V3 ～V4 区和真菌18S rRNA 基因ITS1 区进行了高通量测序。从表5 结果可见，与常规耕作相比，有机耕作小麦根际微生物的Chao1、ACE、Shannon 指数上升，其中细菌增长幅度分别为0.57%、0.71%、4.55%，真菌的增长幅度分别为9.96%、8.71%和11.00%，细菌和真菌的Simpson 指数分别下降42.86% 和38.88%，差异显著（P＜0.05），表明有机耕作下小麦根际微生物群落多样性和相对丰富度显著高于常规耕作。

表5 有机耕作下小麦根际微生物群落Alpha 多样性Table 5 Alpha diversity of microbial community in wheat rhizosphere under organic cultivation.

2.4 有机耕作5 年小麦根际土壤细菌和真菌群落分布和丰度特征

图1A 为小麦根际细菌分布及相对丰度，比较发现，试验样地小麦根际的优势细菌科主要为鞘酯单胞菌科（Sphingomonadaceae）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、诺卡氏菌科（Nocardioidaceae）、亚硝化单胞菌科（Nitrosomonadaceae）和芽单胞菌科（Gemmatimonadaceae）。与常规耕作相比，有机耕作（NT）亚硝化单胞菌科和芽单胞菌科的相对丰度分别提高了24.98%和75.18%，亚硝化单胞菌科属于氨氧化细菌，与土壤氨态氮的转化与吸收有关［13］，而黄单胞菌科、鞘脂单胞菌科和诺卡氏菌科的相对丰度比常规耕作降低了67.95%、33.76%和25.22%，黄单孢菌的大多数种是植物病原菌，鞘脂单孢菌和诺卡氏菌大多具有多环芳烃化合物的降解能力［6］，可能与除草剂、杀虫剂等的使用有关。比较不同生长时期菌群结构的变化（图2）可见，上述菌群结构和丰度的变化主要集中于抽穗期，主要与抽穗期小麦根系代谢活跃有关，此外，常规耕作在返青期施入的肥料、农药等也会对根际菌群产生一定影响。

图1 小麦根际土壤细菌和真菌群落丰度特征Fig.1 Characteristics of bacterial and fungal community abundance in wheat rhizosphere

图2 不同生长时期小麦根际细菌LDA 条形图Fig.2 LDA of microbial communities in rhizosphere at different growth stage

图1B 是小麦根际真菌在属水平上的相对丰度变化。比较发现，除未分类和不可预测的菌群以外，有机耕作下Subulicystidium、锥毛壳属（Coniochaeta）、裂壳属（Schizothecium）和尾柄孢壳属（Cercophora）的丰度较常规耕作高50 倍以上，几乎为有机耕作组的特有菌群。这些真菌大多与纤维素降解有关［14］，该类菌群的聚集无疑会促进土壤有机物的降解和矿化，利于养分的释放和吸收。进一步分析发现，常规耕作下，链格孢菌属（Alternaria）、球腔菌属（Mycosphaerella）、枝孢属（Cladosporium）和帚枝霉属（Sarocladium）等的相对丰度显著高于有机耕作，分别提高了61.53%、50.82%、50.39%和44.06%，这些真菌大多数种是植物病原菌［15］是否与施肥用药有关机制如何待深入研究。

2.5 根际微生物群落分布与土壤理化性状的冗余分析（RDA）

以3 个生长时期的根际优势菌群和土壤理化性状为量纲，分别进行了细菌科（图3A）和真菌属（图3B）水平的冗余（RDA）分析。发现，耕作方式和土壤养分含量是影响根际微生物分布和土壤pH 值的主要因素。常规耕作下大部分优势细菌和真菌与土壤有机质和养分含量呈显著性正相关，包括黄单胞菌、鞘脂单胞菌和诺卡氏菌优势细菌科和链格孢菌属（Alternaria）、球腔菌属（Mycosphaerella）、枝孢属（Cladosporium）和帚枝霉属（Sarocladium）真菌属。在有机耕作下，大部分优势细菌和真菌，包括芽单胞菌和亚硝化单胞菌细菌科，及Pyrenochaetopswas、锥毛壳属、裂壳属3 个真菌属，与土壤有效磷含量呈显著负相关，与全氮呈正相关，与土壤有机质、速效钾的相关性较低，出现该种情形的可能原因是，有机耕作下植物所需养分需通过微生物的分解才能释放，速度慢，变化幅度小，特别是磷元素以开发土壤固定磷为主，土壤速效磷含量较低，为满足微生物活动和生长需要，促使有机质分解微生物活跃并富集。土壤pH 值和土壤有机质和养分呈显著负相关，部分真菌和细菌与土壤pH 值呈显著负相关，这与前人的研究结果相似［16］。

图3 不同生育期根际土壤微生物群落组成与土壤理化性质相关性分析（RDA）Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of microbial community in rhizosphere with physical and chemical properties of soil in different growth stages

3 结论与讨论

3.1 有机耕作对小麦品质、产量和土壤理化性质的影响

因有机耕作施肥主要是有机肥，速效养分的释放和供应较为缓慢，因此在有机耕作的前几年，作物产量会受到影响，一般有机耕作多年后，土壤肥力会持续提高，农田生态环境改善，病虫害下降［17］，有机耕作农产品的产量和品质都会有提高，本研究试验样地为有机耕作的第5 年，产量有所下降属于正常现象。从小麦品质看，尽管有机耕作小麦的粗蛋白和面筋含量有所下降，但面团的最大拉伸阻力明显提高，加工品质得到改善，说明其籽粒蛋白质组成发生了变化，具体机制待深入研究。小麦微量元素含量提高而重金属含量下降值得欣慰，这可能与有机耕作下土壤pH 值升高，重金属有效态下降有关［18］。值得关注的是，尽管有机耕作总养分的投入低于常规耕作，但土壤全氮、碱解氮的含量略有提高，意味着土壤氮的固持率提高了，或是溶淋或溢出减少，或是固氮能力提升，或是在小麦成熟期微生物菌体衰亡量增多，微生物氮释放了，具体原因和机制值得深入研究。此外，表征土壤盐分的电导率下降，pH 值提高，说明土壤理化性状得到恢复和改善，更利于植物的健康生长。速效磷有较大幅度下降，可能原因是有机耕作施入的总磷量较低，加上土壤和根际微生物丰度提高，促进了土壤固定磷的利用，进行连续多年生产后出现了亏缺，该结果同时提示，试验样地需关注磷元素的补充。

3.2 有机耕作对小麦根际微生物多样性和稳定性影响

本研究结果表明，有机耕作模式下小麦根际微生物多样性及丰富度提高，菌群结构稳定，变化较少。α-多样性指数是有效评价土壤微生物群落多样性和物种丰富度的指标。与常规耕作比较，有机耕作模式显著提高了根际细菌和真菌的Chao 1、ACE 和Shannon 指数，根际土壤中细菌和真菌的Simpson指数显著性降低，说明菌群多样性和丰富度均提升。Meena M D［20］等人研究发现，在苹果果园施用堆肥后，根际土壤微生物的多样性增加；Robert Blundell等［17］发现，有机管理模式提高了农田土壤微生物的活性以及多样性。RDA 分析表明栽培方式和生育时期是影响小麦根际微生物群落结果和丰度的主要因素，这与Marschner P 等［20］研究结果一致。此外，有机耕作下土壤微生物群落与土壤养分相关性小于常规耕作，分析原因为有机耕作的土壤养分是在土壤微生物的作用下缓慢释放的，浓度波动小，这与常规耕作施入较多的速效养分有很大差别，也就是说有机耕作对土壤微生物的扰动较少，使微生物群落结构相对稳定，这与Kesia Silva Lourenco 等［21］提出的观点一致。

3.3 有机耕作方式对小麦根际微生物结构的影响

不同农业措施下的作物根际土壤之间细菌和真菌土壤群落结构和组成方面存在差异［22］。从根际细菌分布来看，常规耕作模式下鞘脂单胞菌科、黄单胞菌科、伯克氏菌科、微球菌科和假诺卡氏菌科的相对丰度较高，且主要出现在小麦的返青期和抽穗期。Susanne Schreiter 等［6］人发现鞘脂单胞菌和伯克氏菌可降解多环芳烃化合物或杀虫剂成分，黄单胞菌科则多为尿素转化菌，可能与常规耕作施用较多的化肥和杀虫剂等有关，这些外源物质的投入对上述微生物起到了诱导作用。

有机耕作方式下芽单胞菌科、亚硝化单胞菌科和微杆菌科等相对丰度较高，在抽穗期和成熟期均有分布，在返青期则以嗜热菌纲为主。Cui 等［22］人发现，芽单胞菌科具有钝化重金属能力，可降低重金属在植物体内的积累，这与本研究有机小麦籽粒重金属含量显著下降结果一致。Liu 等［23］在9 年的有机肥长期定位实验中发现，亚硝化单胞菌科具有硝化和好氧氨氧化作用，对土壤氮和硫的循环起着重要驱动作用。微杆菌科则属于耐热菌，多出现在施用堆肥土壤中，与有机质分解有关。

根际真菌群落结构关系到植物养分的供应和安全，从真菌属水平上来看，有机耕作下，小麦根际的Subulicystidium、锥毛壳属、裂壳属和尾柄孢壳属的相对丰度显著增加，这些菌群都与有机质的降解有关，是木质素、纤维素分解酶的重要来源［24］。这几种真菌在根际的富集无疑对土壤有机质的分解矿化，促进养分释放是有益的。有机耕作下，链格孢菌属、球腔菌属以及枝孢属（Cladosporium）等多种植物病原菌［15］的相对丰度大幅度降低，有利于冬小麦的健康生长。

从本研究结果可见，耕作方式对土壤理化性状和微生物群落都会产生较大影响，有机耕作下小麦籽粒的品质和质量得到改善，土壤生态效应显而易见，因时间限制，尚有许多未知因素和变化机制待深入研究，这对指导科学耕作，提高耕地质量，减少肥药投入和化石能源消耗，保障粮食安全都具有重要意义。