石斛无菌播种及培养

2021-12-13王莲辉

大众科学 2021年8期

关键词：石斛无菌培养基

王莲辉

石斛（Dendrobium）属于兰科植物，全球约1500种，中国近80种。生于海拔480～1700米的山地林中树干上或山谷岩石上，主要分布于亚洲热带和亚热带，澳大利亚和太平洋岛屿，我国大部分分布于西南、华南、台湾等地。

石斛是世界上著名的观赏兰花，具有靓丽的容颜，叶披针形，茎肉质稍粗状，花葶从叶腋抽出，花单朵至数多不等，每花3萼片和3花瓣，呈喇叭状散开，色彩斑斓，花型奇特，馥郁芬芳，许多种类还具有极高的药用价值。

贵州省林业科学研究院在石斛资源收集的基础上，针对价值较高的一些种诸如铁皮石斛、球花石斛，扭瓣石斛、翅萼石斛、晶帽石斛、金钗石斛、密花石斛、鼓槌石斛等开展了相关研究。

人工授粉

选取生长健壮的石斛母株，观察石斛花苞的生长状态，接近开放时去雄套袋，待花开5～7天人工授粉，用镊子摘取成熟且具粘性的花粉粘贴于雌蕊柱头上，2～3天花瓣闭合，子房膨大，每种石斛果实成熟期不同。

蒴果采收

无论是昆虫充当媒介还是人工扮演昆虫的角色，只要授粉成功，历经120～180天的等待，种子孕育初见成效，成熟时蒴果由硬变软，颜色由绿变黄即可采收作为外植体。

试验过程

培养基的配制

石斛播种的培养基多种多样，不同品种的最适培养基不同，有些品种加入天然有机物时，能提高种子萌发率，并加快萌发速度和生长速度，这一添加物的运用广泛运用。

石斛的培养基采用M S、1/2MS、KC、花宝3号（3g/L）等为基本培养基，附加细胞分裂素（6-BA、KT、TDZ等）、生长素（α-NAA、IAA、IBA等）及天然有机物（椰乳、香蕉、马铃薯、苹果汁等），所有培养基均按每升葡萄糖30g（生根20g）和琼脂6g作为固定剂，加热完全融化，用0.1mol/L的HCl或NaOH调整pH值在5.2～5.4之间，分装入培养瓶，每瓶40～50ml，用封口膜或塑料瓶盖封口，每一处理20～25瓶。

培养基的消毒

由于培养基含丰富的营养成分，适宜多种细菌和真菌的生长和繁殖，极易造成污染，影响组培的成功，因此培养基消毒是必不可少的，常用的消毒一般采用高温高压消毒法，将盛装一定量培养基的培养瓶放置于蒸气高压灭菌锅内，设定1.05kg/ cm的压力，温度121.3℃，维持20～30min，室温冷却后待用。

无菌材料的获得及播种

由于石斛胚发育不完全，在自然状态下繁殖困难，需与真菌共生才能发芽，存在种子萌发率低，成苗率低的问题，因此不能像其他植物一样在大田或苗床上播种，因此可运用生物技术手段在添加各种营养素的无菌培养基上，采用兰花的无菌播种与试管快速成苗技术促进其萌发生长成苗，在短时间内满足大规模种植种植需求。

无菌播种：建立无菌培养物的过程如下，首先要进行外植体的表面灭菌，待石斛果实成熟未开裂时，剪取果实放在自来水下冲洗表面的脏物2～3小时，将上下两端切除，置于超净工作台上。选用饱满的果实用75%的酒精浸泡20-30秒，再用5%～10%次氯酸钠（NaClO）处理10分钟，最后用0.1%升汞（HgCl2）消毒5分钟，或3%双氧水溶液消毒 5～20分钟，以无菌水冲洗数4～5次。

在操作前准备好所有灭菌工具，保持超净工作台的无菌状态，用无菌滤纸擦干果实后，用解剖刀剥开果皮，用接种针将黄色粉末状胚均匀地撒播于培养基上，播种密度以每瓶数量大致能接触到培养基为宜，太密时会影响发芽率及发芽后的正常生长，播种后稍加振动，使种子充分散布于培养基中。

培养条件：试验材料的各种培养是在培养室内进行的，温度维持在23～25℃。将播种后的玻璃瓶放置于带有两支40W日光灯的培养架上，光照强度30～40μmol.m-2.s-1，时间12h. d-1，温度过高易褐变死亡，温度过低发芽慢。

原球茎培养：石斛种子在所配制的MS或1/2MS添加α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培养基上，接种2～3周胚明显增大，形成白色原球茎，4～5周原球茎转绿，7～8周种胚突破种皮，部分顶端出现绿色叶原基，球体基部有丝状毛。

增殖培养：为获得更多的种苗，将混合有叶原基和原球茎的组织接种于MS或1/2MS添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）1-3mg/L及α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培养基上，3～5周，原球茎伸长长大，叶片从原球茎顶部生出，7-9周第2及第3片叶长出并呈3～5株的丛生带短根的小苗。

壮苗生根：随着幼苗的生长，分瓶移入另外的培养基中，给予充足的生长空间，形成能用于栽培的植株。将长成的丛生植株分开接种到1/2MS或1/4MS添加吲哚乙酸（IBA）0.05～0.5mg/L及α-萘乙酸（NAA）0.5～2mg/L的培养基上，一般每瓶接种15株左右，经5～7周幼根长长，8～10周长成具2-3条根、3～4片叶的完整植株。