井冈蜜柚特色风味代谢基础解析

林 凯，胡重怡，郭 平，王 栋*

(1.江西农业大学，江西 南昌 330045；2.江西省食品检验检测研究院，江西 南昌 330001)

柚[Citrusmaxima(Burm)Merr.]是芸香科、柑橘属植物，乔木。柚子是其开花后成熟果实,又名朱栾、雪柚、气柑、文旦等[1]，在我国已有3000多年栽培历史，广泛分布于我国的广东、广西、福建、台湾、浙江、四川、江西等省份[2]。柚子清香、酸甜、凉润，营养丰富，药用价值很高[3]，是人们喜食的水果之一，也是医学界公认的最具食疗效果的水果之一。柚子具有抗肿瘤、抗氧化、清除自由基和治疗糖尿病的药理作用，同时具有抑制细菌增长、抗炎症和镇痛的功效[4]。柚皮质量占整个柚子质量的30%～40%，传统中医认为，柚果皮具有止咳、化痰、理气、抗炎等功效[5]。柚子富含多种活性成分，包括橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素及橙皮素等黄酮类化合物，还富含生物碱类、香豆素类、柠檬苦素类和其他三萜类化合物，柚子的果皮中富含多种挥发油类物质[2]。

研究柚子的代谢组分有利于深入挖掘柚子的活性成分。万建[6]选择了包括柚子在内的4种柑橘类型，利用液相色谱与质谱联用(Liquid Chromatography Mass Spectrometry，LC-MS)技术进行代谢物的非靶向鉴定与检测，共鉴定出54个代谢物，主要包括氨基酸类、黄酮类和柠檬苦素类物质。目前，关于柚子代谢组分的研究主要集中在多酚类物质，其中又以类黄酮和酚酸物质为主。李汀等[7]在柚果肉膳食多酚粗提物中共鉴定出7种可精确定量的多酚单体：柚皮苷、芸香柚皮苷、野漆树苷、香草酸、甲基橙皮苷、新西兰牡荆苷和阿魏酸，其中柚皮苷含量为50.54 mg/g，显著高于其他6种多酚。柚皮苷是一种二氢黄酮类物质，存在于柚及其变种的果皮及果实中，且是该类水果中的主要黄酮类物质[8]。柚皮苷及其苷元柚皮素在降血脂、镇静、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗真菌、抗动脉粥样硬化、抗脂过氧化和保护肝蛋白等方面具有较强的生物活性和很高的药用价值[9-13]。同时，柚皮苷和柚皮素是造成柑橘类水果苦味的主要物质[14-15]，这也造就了柚子独特的风味。方波等[16]利用超高效液相色谱法同时快速测定柑橘果实中11种类黄酮的含量，结果表明：柚果实中类黄酮含量丰富且各种类之间组分含量差异显著。聂嘉琳等[17]采用超高效液相色谱三重四级杆质谱法，对不同柚子品种的不同部位的酚酸、类黄酮和香豆素类物质进行靶向筛查和定量分析，结果表明：柚子果肉和果皮的活性物质的种类和含量也不尽相同。

原产于福建省漳州市平和县的琯溪蜜柚和原产于广西容县沙田村的沙田柚是目前市场上深受消费者喜爱的2种蜜柚品种，市场占有率高，果肉饱满，味道甜蜜。近年来，经过长期的选育，江西省的特色农产品吉安市周边的井冈蜜柚也开始受到消费者的喜爱，目前与南丰蜜桔、赣南脐橙并称为江西果业三宝，相比于琯溪蜜柚和沙田柚，井冈蜜柚入口偏苦，但回甘明显，味道清甜，与琯溪蜜柚、沙田柚相比，更有柚子味，清甜风味明显具备地理标志性特征。高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱是获得植物代谢物谱的有效技术[18-19]，本研究通过超高液相色谱与飞行时间质谱联用技术，对比不同产地的蜜柚非靶向代谢组分，从中挖掘江西省特色农产品井冈蜜柚风味物质代谢基础，为进一步深入挖掘井冈蜜柚农产品附加值提供了坚实的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

井冈蜜柚采摘于吉安县产地，琯溪蜜柚、沙田柚购买于原产地，每个柚子品种分别取6个样品，分离其柚子肉和柚子皮，-80 ℃真空冷冻干燥后磨至干粉保存。

甲醇(质谱纯)购自美国Honeywell公司，水购自娃哈哈公司，内标利多卡因、橙皮素、柚皮素、橙皮苷、柚皮苷等相应标准品购自美国Sigma公司，蔗糖购自国药集团。0.22有机系滤膜购自日本Shimadzu公司。

1.2 仪器与设备

Acquity UPLC VION IMS QTOF MS超高液相色谱-飞行时间质谱联用仪(UPLC-QTOF-MS)，由美国Waters公司生产；QUINTIX124-1CN电子分析天平(精度≤0.1 mg)，由德国赛多利斯公司生产；Vortex Wizard涡旋仪，由意大利VELP公司生产；Multifuge X1R离心机，由美国赛默飞公司生产。

1.3 样品的前处理

各品种的柚子肉和柚子皮干粉分别称取20 mg于1.5 mL离心管内，加700 μL 90%甲醇水溶液(含10 μmol/L利多卡因内标)后，于涡旋仪涡旋3 min，充分混匀，12000 r/m离心5 min，取上清液，过滤膜后准备上机，每个样品重复2次。

1.4 仪器分析的条件

利用Waters Acquity UPLC VION IMS QTOF MS进行色谱分离和质谱检测，色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC Ethylene Bridged Hybrid(BEH)C18 column(2.1 mm×50 mm，1.7 μm particle size，由美国Waters公司生产)；流动相：以0.1%甲酸水溶液为流动相A和0.1%甲酸乙腈为流动相B进行梯度洗脱，洗脱梯度：0～3 min，5%～50% B；3～12 min，50%～85% B；12～14 min，85%～95% B；14～15 min，95% B保持1 min，15.01～16.00 min，5% B。柱温50 ℃，流速0.3 mL/min，进样量1 μL。质谱条件：毛细管电压3.0 kV，锥孔气50 L/h，去溶剂气600 L/h，离子源温度120 ℃，去溶剂温度500 ℃，低碰撞能量6.0 eV，高碰撞能量25.0～60 eV，扫描范围50～1500 m/z。

1.5 数据分析

利用Progenesis QI 2.3软件对数据进行峰提取、峰对齐，并用EZInfo 2.0软件对3种品种柚子肉、柚子皮进行聚类分析，从中找出井冈蜜柚的特征差异化合物，利用Chemspider数据库对特征差异化合物进行匹配，对匹配到的差异化合物，购买相应标准品进行确证，并利用Waters Unifi 1.8.1软件匹配并筛查黄酮类和酸酚类次生代谢产物。

2 结果与分析

2.1 UPLC-QTOF-MS分离结果

在试验设定的色谱质谱条件下，井冈蜜柚的柚子肉和柚子皮的总离子流如图1所示，出峰主要集中在0.3～7.0 min，随着梯度洗脱时间的延长，非极性化合物在12.0 min后逐步洗脱出峰。

图1 井冈蜜柚柚子肉(A)和柚子皮(B)组分的UPLC-QTOF-MS图谱

2.2 主成分分析

对3种不同品种的柚子肉和柚子皮组分分别利用EZInfo 2.0软件进行主成分分析，其中，共对柚子肉中9600个代谢物进行了聚类，并对柚子皮中9896个代谢物进行了聚类分析，发现不同品种的柚子肉和柚子皮组分均能分别聚类在一起，从载荷图中挑选出各个品种的差异化合物(图2右图红色框选中化合物)在Progenesis QI 2.3软件中进一步利用Chemspider在线数据库进行匹配确定化合物。

图2 3种品种柚子肉(A)和柚子皮(B)主成分分析(左)和载荷图(右)

2.3 差异化合物的预测

笔者对柚子肉和柚子皮中选出来的115个差异化合物进行在线匹配，与匹配到23个差异化合物，发现柚子中的2种典型黄酮类物质——柚皮素(Naringenin)和柚皮苷(Naringin)主要在柚子皮中且含量较高，但在井冈蜜柚果肉中，与其他2种果肉相比，这2种黄酮类化合物含量较高，达到柚子皮中含量相当的水平(图3和图4)。

图3 3种柚子品种的柚子皮和柚子肉中柚皮素的含量

图4 3种柚子品种的柚子皮和柚子肉中柚皮苷的含量

2.4 差异化合物的确定和柚子主要风味物质的解析

笔者对已报道的柑橘属中主要的黄酮类物质标准品(柚皮苷、柚皮素、橙皮苷、橙皮素)进行了定性分析，并对一些已报道的其他酸酚类化合物进行了匹配预测，在柚子中，共检测到以下化合物，具体见表1。

表1 3种不同柚子品种果皮和果肉中代谢物相对含量 mg/kg

柚皮苷、柚皮素2种黄酮类化合物在柚子中的含量较高，而橙皮苷和橙皮素在柚子中只有橙皮苷被检测到，且含量较低。可以看出，虽均为柑橘属植物，但是柚子味和其他柑橘属植物明显不同。井冈蜜柚的蔗糖含量较低，比沙田柚和琯溪蜜柚分别低40.05%和25.57%，而苦味物质柚皮素和柚皮苷含量却比沙田柚和琯溪蜜柚高出4倍左右，在实际品尝中，井冈蜜柚虽不如沙田柚和琯溪蜜柚那么甜，但却更具有柚子味，因而别具风味。

3 结论

柚子是深受消费者喜爱的水果之一，柚子同时也是一种药食同源食物，具备药用价值，中药化橘红是柚的未成熟或近成熟的干燥外层果皮，具有理气宽中、燥湿化痰的功效，主要用于咳嗽痰多、食积伤酒、呕恶痞闷的治疗，化橘红中的黄酮类化合物主要成分为柚皮苷[20]，2015年《中国药典》将柚皮苷含量作为化橘红的标志性成分，规定其含量不得低于3.5%。

本文将井冈蜜柚与沙田柚和琯溪蜜柚这两个市场占有率最高的品种进行了比较，通过UPLC-QTOF-MS构建了3个品种的柚子肉和柚子皮的基础数据库，采用PCA主成分分析进行了聚类分析，找到了三者的差异化合物115个，经过Chemspider数据库比对，笔者从中发现，在井冈蜜柚果肉中富含柚皮素和柚皮苷这2种黄酮类化合物，并利用标品确认并通过内标峰面积计算了其相对定量，结果表明：在井冈蜜柚中的柚皮素和柚皮苷是其他2个柚子品种果肉的4倍，但是井冈蜜柚的蔗糖含量略低于其他2个品种。根据以往文献报道，柑橘果实苦味物质主要分为2类：一类是柠檬苦素类似物，包括柠檬苦素和诺米林；另一类是黄酮类化合物，包括柚皮苷、新橙皮苷，其中柚皮苷是主要的苦味物质[21]。

本文通过非靶向代谢组学解析，井冈蜜柚的微苦风味主要来源柚皮苷和柚皮素。本方法构建的代谢组学数据库可以在后续的研究中继续挖掘柚子的其他组分，利用三萜化合物指纹图谱对不同品种植物油鉴别起到借鉴作用。