生菜子多糖提取方法及其降血脂活性研究

杨丰榕，高建萍，李春燕

（内蒙古医科大学药学院，呼和浩特 010110）

0 引言

生菜子，菊科植物莴苣(Lactuca satyaL.)的干燥种子，又名黑苣胜，是蒙药方剂中较常用的药材之一。蒙医理论中认为其具有消食、调理胃火等功效，不仅可用于腹部鼓胀，面部浮肿等肝病，还可以治疗呕吐以及饮食后肝区疼痛等[1]。现代药理研究后发现生菜子具有降血脂[2]、中枢抑制[3]、抗心律失常[4]等功效，但由于对生菜子的研究较少，其所含化学成分不明确，相关药理活性的作用机制尚不清楚。

经项目前期研究发现生菜子含有的主要化学成分之一为多糖，而多糖的多种药理活性中包括降血脂[5]、降血糖[6-8]、抗氧化[9-11]等，其中多糖降血脂的机制包括直接降低体内胆固醇、减少过氧化物生成等[12]，结合文献中生菜子的降血脂作用，因此本文将生菜子多糖定为研究对象。

多糖的提取方法种类较多，有醇水法[13]、超声法[14]、酶法[15]、微波法[16]等，其中最常用的还是醇水法，通过设计合理的正交试验得到最佳工艺。误差反向传播神经网络，简称为BP神经网络，是人工神经网络中的机器学习方法[17-18]。本研究旨在将BP神经网络法与生菜子多糖提取的正交试验结合，利用BP神经网络法实现过程模拟，考察细微变化对提取结果的影响，进而建立优于正交试验的生菜子多糖的最佳提取方法，同时研究生菜子多糖结合胆酸盐能力从而实现对生菜子降血脂作用机制的初步研究，藉此实现对生菜子的深入研究并为多糖降血脂功效的研究提供部分理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

生菜子，购自内蒙古天力药业，由内蒙古医科大学生药学教研室渠弼教授鉴定为菊科植物莴苣(Lactuca satyaL.)的干燥黑色种子。胆酸钠、牛黄胆酸钠、甘氨胆酸钠（上海源叶试剂公司）、葡萄糖（040510 天津市化学试剂三厂），其余试剂均为国产分析纯。

1.2 主要仪器与设备

752-型-紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）、电子天平（AB135-S；METTLER TOLEDO，TA5003W，上海菁海仪器有限公司）、FZ-600型酸度计（成都世纪方舟科技公司）、旋蒸仪（N-1300D-WB）

1.3 方法

1.3.1 生菜子预处理 生菜子药材经粉碎后，先经石油醚脱脂，再以95%乙醇除低聚糖，后将药材粉末干燥备用。

1.3.2 生菜子多糖提取工艺 采用水醇法：预处理生菜子粉末+蒸馏水→煎煮→真空抽滤→浓缩→80%醇沉→得生菜子多糖，依据公式(1)计算多糖得率。

1.3.3 单因素实验 实验采用的提取温度分别选择50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取时间选择0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次数选择1、2、3、4次，溶剂倍量定为10、20、30、40、50、60倍，将以上4个因素作为生菜子多糖得率的主要影响因素进行单因素考察实验。

1.3.4 正交试验 以提取温度(A)、提取时间(B)、提取次数(C)、溶剂倍量(D)为影响因素，以多糖得率作为指标展开正交设计试验。

1.3.5 基于正交设计的BP神经网络优化[19-21]以正交试验设计中影响生菜子多糖得率的4 个主要因素作为4个输入节点建立的B P 神经网络输入层，以得率作为输出节点建立输出层，将综合评分作为评价指标。采用MAT LAB 7.0软件实施编程，其中隐含层传递函数最终选择tansig 双曲正切传递函数，而输出层传递函数则选择purelin线性传递函数。

1.3.6 生菜子多糖体外结合胆酸实验

（1）样品制备。取生菜子药材粗粉，44倍蒸馏水，89℃提取1.6 h，提取4次，得生菜子多糖提取液。浓缩后，以60%乙醇、80%乙醇分级醇沉、90%乙醇直接醇沉，得到3 个样品，分别为：60%醇沉生菜子多糖、80%醇沉生菜子多糖、生菜子粗多糖。

（2）胆酸盐标准曲线的绘制[22]

步骤：（1）以磷酸缓冲溶液(0.1 mol/L、pH 6.3)配制0.3 mmol/L 的牛磺胆酸钠(STC)、甘氨胆酸钠(SGC)和胆酸钠(SC)溶液，备用；（2）分别取上述胆酸盐溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 具塞试管中，以磷酸缓冲溶液补充至2.5 mL；（3）加入7.5 mL 硫酸溶液（质量分数60%）；（4）70℃水浴20 min 冰浴5 min；（5）于387 nm处测定吸光度值；（6）以吸光度值和胆酸盐浓度绘制标准曲线。

（3）胆酸盐结合实验。取1 mL 的多糖溶液（粗多糖，60%醇沉，80%醇沉，分别配置成0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL）于10 mL 具塞试管中，加入1 mL HCl 溶液(0.01 mol/L)，37℃恒温1 h，以NaOH溶液(0.1 mol/L)调节pH 6.3，随后加入4 mL 胰酶（10 mg/mL，pH 6.3 的0.1 mol/L 磷酸缓冲液配制），于37℃恒温震荡1 h 后，每个样品中分别再加入4 mL 不同的胆酸盐溶液，于37℃恒温振荡1 h后，待胆酸盐被充分结合后，4000 r/min，离心20 min。上清液按1.3.6.2项下方法测定胆酸盐含量。

2 结果与分析

2.1 单因素考察结果

单因素考察结果见图1～4。当生菜子多糖的提取温度为50℃～70℃时，多糖得率与温度成正比，高温促使多糖的溶出加速，但是当温度超过70℃时，高温可能导致使多糖发生降解或者一定程度的糊化，从而使多糖的得率下降；当提取时间为0.5～1.0 h 时，时间与多糖得率成正比，当提取时间超过1.5 h 时，多糖的得率基本趋于稳定；提取次数与多糖得率成正比，次数越多提取越充分，经过提取3次后多糖得率则趋于平稳；溶剂用量越多，多糖得率越高，但大量提取液需要浓缩，导致时间和能源的浪费，因此应选择适当的溶剂倍量。

图1 提取温度对黑苣胜多糖提取率的影响

2.2 正交试验结果

依据单因素考察结果建立正交设计实验，相关因素和水平及试验结果见表1～3。由表3可知，提取次数是生菜子多糖的提取工艺的主要影响因素，其余各个因素对生菜子多糖得率无显著影响。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 生菜子多糖提取实验方差分析表

2.3 BP神经网络优化结果

本实验所建立的BP 神经网络最大学习步长为1000，目标精度0.001，训练过程稳定迅速，其稳定性结果可见图5～6。此网络以正交试验所得数据作为参考数据，模拟提取实验中未进行的数据考察，可以由计算机实现1℃、1 倍水量、1 min 对生菜子多糖得率的影响，从而得到最优结果。固定3个影响因素，仿真一个因素后所得的工艺为：89℃，44倍水，提取4次，1.6 h/次，结果见图7～10。

图2 提取时间对黑苣胜多糖提取率的影响

图3 提取次数对黑苣胜多糖提取率的影响

图4 溶剂的倍量对黑苣胜多糖提取率的影响

图5 误差收敛曲线

图6 回归相关性拟合曲线

图7 针对提取温度的仿真

图8 针对提取时间的仿真

图9 针对溶剂倍量的仿真

图10 针对提取次数的仿真

2.4 生菜子多糖体外结合胆酸实验结果

由表4可知，生菜子粗多糖（粗）、60%醇沉(60%)、80%醇沉多糖(80%)对牛磺胆酸钠(STC)、甘氨胆酸钠(SGC)和胆酸钠(SC)都有较好的结合率，并与多糖浓度在一定范围内呈正比。

表4 不同生菜子多糖对3种胆酸盐的结合率

3 讨论

通过本项目研究补充了目前针对生菜子这味药食同源蒙药的研究，发现了其所含主要化学成分是多糖，并对生菜子多糖的提取分离方法进行了研究，填补了此味药材在化学成分提取方法上的空白。由项目最终多糖得率可知采用BP 神经网络模型所得的生菜子多糖提取工艺优于正交试验，并且在不增加试验次数的基础上就可以考察到更细微的条件变化，节约人力物力，仅利用少量数据即可通过计算机软件分析各个影响提取的因素对生菜子多糖得率的影响规律，并找到最佳参数且此结果优于正交试验结果，说明BP神经网络法值得用于化学成分提取工艺的改进。

本研究通过利用模拟肠胃条件的方法进行了生菜子多糖胆酸盐结合试验，发现多糖浓度高于2 mg/mL时，对胆酸钠的结合率反而下降，可能是由于多糖分子比较大，当浓度过高时，在空间上阻碍了其与胆酸钠的结合，尚需结合体内实验进一步研究。

有学者认为药食同源的植物中功能性成分能够于肠道结合内胆酸盐，部分可以通过影响脂类消化和吸收降血脂，还可以通过影响胆酸盐的肠肝循环，使之排出体外，并促使胆固醇向胆酸盐转化来降低血脂[25-26]，结合本项目研究结果，可初步判断生菜子降低血脂的药理作用机制为生菜子多糖对胆酸盐的结合作用，从而表明多糖是生菜子药材降血脂效果的主要有效成分之一，能够为以后蒙药生菜子药理活性研究打下了基础并指明将来的研究方向。

4 结论

正交试验作为常见的研究设计方法，不但经济、高效、快速，而且可以针对多因素多水平，局限是只能优化研究者提供的多个水平的组合，而BP神经网络可以学习规则，并实现自身训练，不仅能够给定范围寻优，还能预测范围中的最优值，得到更加可靠，稳定的结果[23-24]。

根据本项目优化得到的工艺平行进行3次生菜子多糖的提取实验，结果发现此工艺中多糖得率优于正交试验结果，平均为11.17%，证明此最优工艺稳定并且可行，同时具有良好的重复性。

在生菜子多糖的胆酸盐结合实验中，随着3 种多糖的浓度增大，对牛黄胆酸钠的吸附力增强，当多糖浓度高于2 mg/mL 时，对其结合率基本稳定。多糖浓度增加，对甘氨胆酸钠的吸附能力呈正比，在多糖浓度为3 mg/mL 时达到吸附最大值，表明生菜子多糖可以重点吸附此类胆酸盐。而3种多糖对胆酸钠的吸附在多糖浓度为0.5～2 mg/mL时，逐步增加，但是当多糖浓度高于2 mg/mL 时，对胆酸钠的结合率反而下降。在3种多糖中，生菜子粗多糖对不同胆酸盐的结合率最佳，其次是60%醇沉多糖，80%醇沉多糖。

本项目仅从体外对生菜子多糖的降血脂作用进行了研究，后期实验将进一步对生菜子多糖在高血脂动物模型中的降血脂能力进行研究。