5 株湖南猪圆环病毒1 型全基因组测序与遗传进化分析

何世成，王紫微，2，王 成，胡巧云，唐小明，王卫国，谢怡灵，王昌建

（1.湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014；2.衡阳技师学院，湖南衡阳 421101；3.湘西州动物疫病预防控制中心，湖南吉首 416000）

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）是圆环病毒科圆环病毒属成员，其表面无囊膜包裹，呈二十面体对称，直径为13～25 nm，具有环状单股负链DNA 基因组，是最小的动物病毒之一[1]。PCV 按致病性、抗原特异性可分为猪圆环病毒1型（PCV1）、猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪圆环病毒3 型（PCV3）及猪圆环病毒4 型（PCV4）[2]。PCV1 发现较早，于1974 年在猪肾细胞中被发现[3]，但该病毒不会造成猪细胞病变。20 世纪90 年代后期发现PCV2[4]，2016 年发现PCV3[5]，2019 年发现PCV4[2]。但随后发现的这些基因型病毒对猪均具有严重致病性。目前普遍认为PCV1 对猪无致病性。也有研究[6]证明PCV1 体外感染能对猪肺泡巨噬细胞的功能产生影响，但时间较短。此外还发现，PCV1 可以在55 日胎龄接种的猪胎儿肺中有效复制，并对猪胎儿的肺部造成以严重出血为特征的微观病变[7]。

PCV1 基因组全长1 758、1 759 或1 760 bp，包括11 个潜在阅读框（open reading frames，ORF），主要是ORF1 和ORF2。ORF1 的主要功能是编码与病毒复制相关的蛋白（Rep 蛋白），被认为是PCV 基因组中最保守的区域；ORF2 的主要功能是编码病毒衣壳蛋白（Cap 蛋白，由233～234个氨基酸组成[8]）。为了解湖南省的PCV1 遗传变异情况，本研究对从猪场病料和屠宰场中检测到的病毒序列进行了遗传进化分析。

1 材料与方法

1.1 材料

在湖南省821 份临床病料和屠宰场猪淋巴结样品中，选取16 份PCV1 阳性（Ct ≤30）的样品核酸。

1.2 主要试剂和设备

2×TaqMaster Mix，购自安诺论生物科技有限公司；50×TAE 缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司；Agarose，购自BIOWEST；Super GelRed核酸凝胶染料10 000×，购自苏州宇恒生物科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker 和DNA 凝胶回收试剂盒，购自东盛生物科技有限公司；PCR 扩增仪，购自西安天隆科技有限公司；琼脂糖凝胶电泳仪，购自北京六一仪器厂；紫外凝胶成像仪，购自北京赛智创业科技有限公司。

1.3 引物设计

PCV1 全基因扩增引物对P1 和P2，根据GenBank 数据库中下载的PCV1 全基因序列，用Primer Premier 5 软件设计，引物信息见表1。

表1 PCV1 全基因PCR 扩增引物信息

1.4 全基因组扩增及测序

反应总体系为25.0 μL：无菌无核酸酶水7.5 μL，2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，DNA 模板3.0 μL。

PCV 扩增反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性20 s，63 ℃（P1）/64 ℃（P2）退火30 s，72 ℃延伸1 min，共37 次循环；72 ℃延伸10 min。

反应完成后取5.0 μL 扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳35 min，紫外凝胶成像仪中观察结果、拍照。阳性条带切胶回收后编号，送擎科生物有限公司进行双向测序。

1.5 遗传进化分析

将同一编号的4 个不同测序结果，通过DNAstar 中的SeqMan 软件进行拼接获得全基因序列，利用NCBI 的BLAST 进行比对分析，选取国内外16 株PCV1 序列（表2）作为参考。

表2 PCV1 参考序列

全基因及ORF2 核苷酸序列同源性，利用DNAstar 中的MegAlign 软件进行比对；系统遗传进化树，使用MEGA-X64 生物软件绘制，通过软件中的Clustal W 法进行比对；构建进化树时，采用Neighbor-Joining 法；Cap 蛋白氨基酸序列，用MegAlign 软件Clustal W 法进行比对分析。

2 结果与分析

2.1 全基因组扩增

使用P1、P2 引物，对PCV1 检测结果为阳性的样品进行全基因组扩增，成功扩增出亮带，产物与预期片段一致（图1），分别为1 046 和1 198 bp。共扩增获得5 株PCV1 全基因组（表3），其中3株全基因大小为1 759 bp，另外2 株大小分别为1 758、1 760 bp（PCV1-HN137-2018 在994 位 点缺失A或G，PCV1-HY577-2020在994位点增加T）。

图1 PCV1 全基因组的扩增结果

表3 PCV1 分离株的来源信息

2.2 遗传进化分析

对本试验获得的5 株PCV1 全基因组与国内外上传至GenBank 中的16 株PCV1 全基因组序列及ORF2 序列，使用MEGA-X64 生物软件绘制系统遗传进化树。

从PCV1 全基因组序列系统遗传进化树（图2）中可看出，PCV1-HH95-2018、PCV1-HY553-2020、PCV1-HN137-2018 和PCV1-YY854-20204 位于同一大分支中，与大部分国外PCV1 分离株分属于两大分支。

图2 PCV1 全基因组遗传进化树

从ORF2序列系统遗传进化树（图3）可以看出，本研究所获得的5 株PCV1 ORF2 序列在均在同一大的分支中，与大多数国外PCV1 分离株ORF2 序列分列在两个大的分支中，与多株广西参考株亲缘关系较近。

图3 PCV1 ORF2 遗传进化树

较为特别的是PCV1-HY577-2020，在全基因进化树中单独属于一个分支，但在ORF2 进化树中与本研究中的其他分离株均在同一分支中，说明PCV1-HY577-2020 存在一定程度变异，但ORF2序列突变不明显。

2.3 同源性分析

对本研究获得的5 株PCV1 全基因组及国内外上传至GenBank 中的16 株PCV1 全基因组序列进行同源性分析和ORF2 序列同源性分析，发现本研究获得的5 株PCV1 全基因组同源性为98.4%～99.7%（图4），与国内外的PCV1 全基因组同源性为98.1%～99.7%。本研究获得的PCV1-HH95-2018 与PXC1-HY553-2020 同源性 最 高（99.7%），与其同源性最高的分离株为2015 年国内分离的GXbb158（KX827782.1）分离株（99.4%）。而同源性最低的是PCV1-HY577-2020，与2006 年哈尔滨分离株PCV1/G（JN398656.1）同源性为98.1%。

图4 PCV1 全基因组核苷酸序列同源性比较结果

本研究获得的5 株PCV1ORF2 序列同源性为97.6%～99.6%（图5），与国内外的PCV1 ORF2 同源性为96.9%～99.9%。其中本研究获得的PCV1-HH95-2018 与国内2015 年分离的GXbb158（KX827782.1）同源性最高（99.9%），而同源性最低的是PCV1-HY577-2020 与国外2015 年匈牙利的Szeged（KX816645.1）分离株和国内2006 年哈尔滨分离株PCV1/G（JN398656.1），同源性为96.9%。

图5 PCV1 ORF2 核苷酸序列同源性比较结果

2.4 ORF2 氨基酸序列比对

本研究获得的5 株PCV1 ORF2 序列翻译的Cap 蛋白均由233 个氨基酸组成。PCV1 ORF2 氨基酸序列比对结果见图6。从比对结果可以看出，PCV1 ORF2 氨基酸中的第53、63、69、116 和176 位氨基酸具有明显的突变。英国、美国、匈牙利和澳大利亚分离株的这几个位点都与国内分离株不同，说明国内外的PCV1 ORF2 氨基酸存在差异。此外，还存在部分分离株单一位点的突变。

图6 PCV1 ORF2 氨基酸序列比对结果

本研究获得的5 株PCV1 中，PCV1-HN137-2018、PCV1-HY577-2020 和PCV1-YY854-2020 与其他参考分离株相比，无明显差异，未发现突变。而PCV1-HH95-2018 和PCV1-HY553-2020 在第116 位氨基酸与其他分离株存在差异，其中PCV1-HH95-2018 在第133 位氨基酸由P 变为T。

3 讨论

PCV1 在1974 年被发现并证实不会造成猪细胞病变，对猪无致病性。另一方面PCV1 与PCV2基因组结构相似，又具有Rep 蛋白存在抗原交叉而Cap 蛋白不存在抗原交叉的特性[9]。因此，常在研制嵌合病毒疫苗时以PCV1 作为载体，构建存在PCV2 ORF2 基因的嵌合病毒[10-11]。但也有研究[8]发现，PCV1 对猪胎儿肺部可造成以严重出血为特征的微观病变，可能对仔猪免疫系统具有潜在危害。2008—2015 年国内不同地区的PCV1 阳性检出率为6.39%～34.00%[12-15]。

本研究获得5 株PCV1 全基因组，其中2 株在994 位点存在核苷酸缺失或增加。该位点位于P1 引物5'的100 位点后，测序结果较为准确，测序波峰清晰，波距均匀且无杂峰，因此认为测序结果置信，证实该位点发生了基因变异。但994 位点不在ORF1 和ORF2 中，因此对氨基酸序列无影响。涂伟[14]首次报道出现不同长度片段的PCV1 全基因组。系统发育树显示，本研究获得的5 株PCV1均属于同一分支，并显示出一定的地理差异，与多株广西参考株亲缘关系较近，但差异较小，同源性均在97.6%以上。王伟丞等[16]、涂伟[14]研究获得的PCV1 分离株全基因同源性均大于98%，与本研究结果相似，表明国内外PCV1 分离株较为保守。

PCV1 氨基酸经比对显示出地理差异，国内与国外分离株的部分氨基酸位点存在明显差异。本研究获得的PCV1 仅在第133 位氨基酸位点存在一个与参考分离株不同的氨基酸。而2015 年广西省扩增的13 株PCV1 分离株共存在6 个与参考分离株不同的氨基酸突变，但在遗传进化树中处于同一分支[15]，说明尽管PCV1 ORF2 氨基酸存在点突变，但是未进化出不同的PCV1 亚型，具有较为稳定的特质。

综上所述，湖南省流行的PCV1 毒株基因稳定性较高，分离株间差异较小。本研究成功扩增测序了5 株PCV1 全基因组，为湖南省猪圆环病毒病防控及相关研究奠定了基础。