补肾解毒方对放射后小鼠血清白细胞介素6、白细胞介素10和外周血白细胞的影响

余雷， 杨云霜， 曹慧敏， 李延晖， 邹梦颖， 刘晓辰， 张蓉

（1.火箭军特色医学中心中医与康复医学科，北京 100088；2.苏州大学，江苏苏州 215000；3.火箭军特色医学中心医研部，北京 100088）

随着放射技术的高速发展，人们在享受它带来丰富受益的同时也面临着放射性损伤。长期的放射暴露容易造成免疫损伤，引起炎症反应，炎性因子对临近细胞造成影响，进而又加剧机体组织损伤。白细胞介素（IL）6是重要的促炎因子，IL-10为多效抗炎细胞因子，它们的动态变化反映了机体的炎症水平及免疫状态[1]。补肾解毒方为火箭军特色医学中心医研部张蓉博士自拟方剂，旨在研发出一种新型、低毒的放射防护剂。本课题组前期研究发现该方能减轻放射后胸腺、脾等免疫器官损伤[2-3]。细胞因子是重要的炎症介质和免疫调节因子，因此，本研究观察补肾解毒方对放射后小鼠血清IL-6、IL-10分泌水平的调控作用，同时观察其对受损白细胞的保护作用，探讨放射后补肾解毒方的抗炎抗损伤作用，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物72只SPF级C57BL∕10J小鼠，7~8周龄，体质量（23±3）g，由南京大学生物医药研究院培育，动物生产许可证号：[SCXK（苏）2018-0008]。于北京师范大学生命科学院实验动物中心饲养，温度25℃，湿度50%，提供正常光照条件，所有动物均可自由进水摄食。

1.2 药物补肾解毒方，方剂组成：熟地黄10 g，牡丹皮10 g，山萸肉12 g，茯苓10 g，山药10 g，冬虫夏草3 g，泽泻10 g，白花蛇舌草10 g。由康仁堂药业有限公司配制成中药颗粒制剂。将颗粒制剂与生理盐水混合后加热，配制出浓度为1.38g∕mL的混悬液，以备灌胃。

1.3 辐射源60Coγ-辐射装置，由北京师范大学提供，北京伽玛高新有限公司生产，型号：GM-11-03-A。

1.4 主要试剂与仪器IL-6酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（规格型号：96T，购自北京瑞格博科技发展有限公司）；IL-10 ELISA试剂盒（规格型号：96T，购自北京瑞格博科技发展有限公司）。Thermo Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Scientific公司）；CT15RT高速台式冷冻离心机（上海天美科学仪器有限公司）；电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）。

1.5 实验动物分组及处理方法将72只小鼠按随机数表分为3组，即空白对照组、单纯放射组、放射+中药组，每组24只。适应性饲养3 d后开始给药。参照人体给药剂量（13.5 g∕kg），按公式转换为小鼠给药剂量[4]。放射+中药组每日予以补肾解毒方汤剂1.54 g∕mL灌胃0.2 mL，1次∕日，空白对照组和单纯放射组给予等体积（0.2 mL）生理盐水灌胃。连续灌胃第11天，除空白对照组外，其余小鼠全部接受与照射源同等距离的一次性4 Gy60Coγ-射线全身照射。照射后各组每日继续灌胃至实验结束，方法同前。共灌胃25 d。并于照射后第1、7、14天取材，每组随机抽取8只，称其体质量，并眼球取血处死，分离血清。

1.6 血清IL-6、IL-10水平测定收集血液上清，采用ELISA法，严格按照试剂盒操作步骤进行，根据标准曲线的回归方程，计算出小鼠血清IL-6、IL-10水平。

1.7 血清白细胞数应用全自动生化仪检测白细胞数。

1.8 统计方法数据分析采用Graphpad Prism 5.0软件，数据描述使用均数±标准差（±s），3组间比较采用两因素方差分析，两两比较使用Tukey法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况比较小鼠在照射后一般情况均较照射前差，具体表现为体质量减轻、活跃度下降、精神状态不佳、皮毛光泽度下降，尤其单纯放射组程度更甚，5只小鼠出现毛发块状脱落的症状。

2.2 各组小鼠照射后体质量变化比较表1结果显示：照射后第1天，小鼠体质量各组间差异无统计学意义（P>0.05）；照射后第7天，单纯放射组小鼠体质量低于空白对照组和放射+中药组（P<0.05或P<0.01）；照射后第14天，单纯放射组小鼠体质量低于空白对照组（P<0.01），放射+中药组小鼠体质量与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组小鼠体质量变化比较Table 1 Comparison of body mass changes of mice in various groups （±s，g）

表1 各组小鼠体质量变化比较Table 1 Comparison of body mass changes of mice in various groups （±s，g）

①P<0.01，与同时间点空白对照组比较；②P<0.05，与同时间点单纯放射组比较

组别空白对照组单纯放射组放射+中药组照射后第14天26.07±1.27 23.19±1.52①24.67±1.65鼠数（只）888照射后第1天24.29±1.96 23.58±1.26 23.91±1.44照射后第7天25.32±2.24 21.98±1.75①24.09±1.73②

2.3 各组小鼠照射后血清IL-6水平比较表2结果显示：照射后第1天，单纯放射组血清IL-6水平高于空白对照组（P<0.01），放射+中药组血清IL-6水平低于单纯放射组，但差异无统计学意义（P>0.05）；照射后第7、14天，单纯放射组血清IL-6水平高于空白对照组和放射+中药组（P<0.01），而放射+中药组血清IL-6水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组小鼠血清IL-6水平比较Table 2 Comparison of serum IL-6 Level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

表2 各组小鼠血清IL-6水平比较Table 2 Comparison of serum IL-6 Level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

①P<0.01，与同时间点空白对照组比较；②P<0.01，与同时间点单纯放射组比较

组别空白对照组单纯放射组放射+中药组照射后第14天21.68±1.77 32.14±3.92①22.15±3.02②鼠数（只）888照射后第1天21.95±2.63 28.21±4.53①24.94±2.98照射后第7天22.14±2.8 32.22±4.33①24.71±2.88②

2.4 各组小鼠照射后血清IL-10水平比较表3结果显示：照射后第1、14天，3组间差异无统计学意义（P>0.05）；照射后第7天，放射+中药组IL-10水平高于空白对照组（P<0.01）。

表3 各组小鼠血清IL-10水平比较Table 3 Comparison of serum IL-10 level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

表3 各组小鼠血清IL-10水平比较Table 3 Comparison of serum IL-10 level of mice in various groups （±s，ng·L-1）

①P<0.01，与同时间点空白对照组比较

组别空白对照组单纯放射组放射+中药组照射后第14天101.33±6.59 110.37±8.47 111.68±9.71鼠数（只）888照射后第1天101.53±9.33 107.93±5.77 110.19±10.28照射后第7天102.11±7.97 108.37±9.28 113.55±9.87①

2.5 各组小鼠照射后外周血白细胞水平比较表4结果显示：照射后第1、7天，单纯放射组和放射+中药组白细胞水平低于空白对照组（P<0.01），放射+中药组白细胞水平高于单纯放射组（P<0.05或P<0.01），与空白对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；照射后第14天，单纯放射组白细胞水平低于空白对照组（P<0.01），放射+中药组白细胞水平高于单纯放射组，与空白对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表4 各组小鼠外周血白细胞水平比较Table 4 Comparison of serum leukocyte level of mice in various groups（±s，×109个·L-1）

表4 各组小鼠外周血白细胞水平比较Table 4 Comparison of serum leukocyte level of mice in various groups（±s，×109个·L-1）

①P<0.01，与同时间点空白对照组比较；②P<0.05，③P<0.01，与同时间点单纯放射组比较

组别空白对照组单纯放射组放射+中药组照射后第14天10.01±0.89 8.73±0.65①9.42±0.83鼠数（只）888照射后第1天10.07±0.87 6.52±0.75①7.67±0.72①②照射后第7天9.94±0.87 7.24±0.71①8.61±0.70①③

3 讨论

长期暴露于中低剂量射线中引起的健康问题一直备受关注。在医疗领域，中西医结合治疗疾病的手段越来越多地在临床中应用，尤其在肿瘤治疗方面，化疗患者都经受着不同程度的放射后遗症。中药能有效降低化疗后副作用，减轻炎症反应[5]，弥补了现代医学的不足。目前，国内外应用中药治疗放射损伤越来越受到重视，而控制感染成为抗放射损伤的首要环节。

IL-6由巨噬细胞、成纤维细胞等产生[6]，是介导炎症反应的重要细胞因子，是机体发生感染的重要指标[7]。本研究结果显示，照射后第1天，单纯放射组IL-6水平高于空白对照组，而放射+中药与空白对照组无显著性差异，表明照射初期，补肾解毒方即发挥了放射防护效应，通过抑制IL-6水平的升高减轻了机体炎性反应。Geginat和Jiang等[8-9]研究发现，急性炎症期血清IL-6水平比CRP上升更早，是判断炎症程度及预后的重要指标。本研究结果显示，单纯放射组IL-6水平在照射后第1天显著升高，与这一发现相符。照射后第7、14天，单纯放射组高于空白对照组和放射+中药组，表明照射后服用中药，机体能继续发挥抗感染作用，而单纯放射组IL-6水平无降低趋势，说明照射中后期，机体仍处于较活跃的炎症状态，自身修复机能难以遏制感染的发展，因此，放射后出现感染状态需人为进行药物干预，防止促炎因子过度表达爆发炎症级联反应[10]，同时这一现象也证实了研发高效中药防护剂的重要性。

IL-10主要由辅助性T淋巴细胞（Th）2细胞产生，介导调节Th1∕Th2细胞平衡[11]，抑制促炎因子合成释放，促炎因子与抑炎因子相互作用，维持体内炎性反应和免疫反应平衡[12]。本研究结果显示，照射后第7天，放射+中药组IL-10水平高于空白对照组和单纯放射组，表明补肾解毒方通过上调IL-10水平，抑制促炎因子释放而发挥抗炎作用，照射后单纯放射组IL-10水平升高，但与空白对照组间差异无统计学意义，考虑到放射后炎性因子增加，IL-10作为主要的抑炎因子必然随之增加。白细胞通常也被称为免疫细胞，是外周血非常重要的一类细胞，在机体中担负许多重任，包括吞噬异物并产生抗体，抵御病原体入侵等，它对射线敏感，接受辐射后白细胞水平会迅速下降。本研究结果显示，放射+中药组白细胞水平高于单纯放射组，表明中药有效减轻了放射所致白细胞减少，从而发挥免疫防护作用。

炎症反应是照射后最常见的症状[13]，炎性因子对临近细胞造成影响，进而又加剧机体组织损伤，中医药在治疗感染方面具有其独特的优势。放射从中医学角度可称之为“火毒之邪”，易耗津伤阴，最损肾中真阴[14]。补肾解毒方由滋补肾阴基础方六味地黄丸化裁而来。现代研究已证实，六味地黄丸具有调节机体免疫、抗肿瘤的作用[15]。加入白花蛇舌草以清热解毒，可发挥抗感染免疫功能[16]。加入冬虫夏草以补肺益肾，Jing Y等[17-18]发现它的有效成分虫草多糖能激活网状内皮系统，增强非特异性免疫。针对放射的“火热”之性，诸药合用拟成的补肾解毒方，可共奏扶正祛邪之功。

综上所述，补肾解毒方通过抑制放射后IL-6分泌水平，提升IL-10水平，并减轻放射所致白细胞数减少，发挥抗炎抗损伤作用。促炎因子与抑炎因子的动态水平变化发挥着免疫调节作用[19]，其中IL-6和IL-10是它们的典型代表，补肾解毒方是否还能通过其他细胞因子发挥放射防护作用，需进一步探讨。