桑根酮C对游离脂肪酸诱导人肝癌HepG2细胞脂质蓄积的改善作用

邢菊玲 刘芬 冯萌 郝梦娇 黄天来 周欣欣 汤湘江

摘 要 目的：研究桑根酮C對游离脂肪酸诱导的人肝癌HepG2细胞脂质蓄积的改善作用。方法：将HepG2细胞分为对照组、模型组、非诺贝特组（10 μmol/L）和桑根酮C低、中、高浓度组（2、4、8 μmol/L），除对照组外，其余各组细胞加入1 mmol/L游离脂肪酸以诱导建立脂质蓄积模型，且各给药组加入相应含药培养基进行培养。采用油红O染色法观察细胞中脂质蓄积情况，并测定脂质水平和三酰甘油（TG）含量;采用实时荧光定量聚合酶链式反应法和Western blot法检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体α （PPARα）、肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）、成脂甾醇元件结合蛋白固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（FAS）、沉默信息调节因子1（SIRT1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α（PGC-1α）的mRNA和蛋白表达水平。结果：与对照组比较，模型组细胞核明显萎缩、体积变小，脂滴数明显增加;细胞中脂质水平、TG含量以及SREBP-1c、FAS 的mRNA和蛋白表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α 的mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P<0.01）。与模型组比较，桑根酮C各浓度组细胞核萎缩不明显、体积大小正常，脂滴数明显减少;细胞中脂质水平、TG含量以及上述PPARα通路相关基因的mRNA和蛋白（桑根酮C低浓度组的SREBP-1c蛋白除外）表达水平均显著逆转（P<0.05或P<0.01）。结论：桑根酮C可改善HepG2细胞的脂质蓄积;其作用机制可能与调节PPARα信号通路、提高细胞脂质氧化能力、抑制脂质合成有关。

关键词 桑根酮C;HepG2细胞;脂质蓄积;PPARα信号通路

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the improvement effects of sanggenone C on lipid accumulation in human liver cancer HepG2 cells induced by free fatty acid （FFA）. METHODS： HepG2 cells were divided into control group， model group， fenofibrate group （10 μmol/L）， sangerone C low， medium and high concentration groups （2， 4， 8 μmol/L）. Except for control group， other groups were treated with 1 mmol/L FFA to induce lipid accumulation model， and administration groups were cultured with relevant medium containing drugs. The lipid accumulation was observed by oil red O staining， and lipid level and triglyceride （TG） content were also determined. Real-time PCR and Western blot assay were adopted to detect the mRNA and protein expression of PPARα， CPT-1， SREBP-1c， FAS， SIRT1 and PGC-1α in HepG2 cells. RESULTS： Compared with control group， the nucleus was atrophied significantly and the volume became smaller， and the number of lipid droplets was significantly increased; the level of lipid， TG content， mRNA and protein expression of SREBP-1c and FAS were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）， mRNA and protein expression of PPARα， CPT-1， SIRT1 and PGC-1α were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， no obvious nucleus atrophy and normal volume were observed in sangerone C groups， and the number of lipid droplets was significantly reduced; the levels of lipid， TG content， mRNA and protein expression of PPARα pathway related genes （except for SREBP-1c protein in saggenone C low concentration group） were significantly reversed （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Sangenone C can significantly improve the lipid accumulation of HepG2 cells， and its mechanism may associated with regulating PPARα signaling pathway， improving cell lipid oxidation ability and inhibiting lipid synthesis.

KEYWORDS   Sanggenone C;HepG2 cells;Lipid accumu- lation; PPARα signaling pathway

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种以外周脂肪分解增加、游离脂肪酸摄取增多、线粒体β-氧化减少和脂质在肝脏蓄积为主要特征的肝脏病变[1]。多项研究表明，NAFLD与胰岛素抵抗、肥胖、高脂血症、2型糖尿病和血脂异常等代谢性疾病等相关[2-3]，是诸多疾病的主要诱因。在我国，成年人的NAFLD患病率高达15%～30%，已取代乙型病毒性肝炎成为第一大慢性肝病[4]。目前，治療NAFLD的药物主要包括抗氧化剂、他汀类药物、调脂类药物等[5]，但他汀类药物会导致肌肉毒性、肝毒性和糖尿病等不良反应[6]。现代研究表明，中药治疗NAFLD的疗效较好、毒副作用小，且中药中所含的黄酮类、苷类和生物碱类等成分可通过抗氧化、抗炎、抗纤维化、改善肝脏脂肪变性等多种途径来预防和治疗NAFLD[7]。

桑白皮是桑科植物桑Marus alba L.的干燥根皮，具有抗炎、抗癌、抗肿瘤、抗病毒、降血压、降血糖、降血脂、镇咳平喘和利尿等作用[8-9]，是治疗前列腺癌、高血压、高血脂和糖尿病等疾病的常用中药[10-11]。其中，桑根酮C（Sanggenone C）是桑白皮中的黄酮类有效成分之一，其化学结构明确（见图1），是桑白皮药材的质量控制指标[12]。

过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）信号通路在NAFLD的发病过程中具有重要的调节作用，能有效控制脂肪酸转运与氧化、脂质合成和分解等代谢过程，维持机体脂质代谢平衡[13]。PPARα表达上调会促进肉碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活物1α（PGC-1α）等的表达;其中，CPT-1位于线粒体外膜上，是长链脂肪酸氧化的关键调节酶和限速酶，其水平降低会直接加剧细胞内脂质堆积;PGC-1α能与PPARα协同作用，促进线粒体脂肪酸氧化、增加机体能量消耗，最终达到降脂的效果[14]。此外，在脂质合成过程中，PPARα还能促进成脂甾醇元件结合蛋白固醇调节元件结合蛋白1c（SREBP-1c）的转录过程，从而抑制脂肪酸合成基因脂肪酸合成酶（FAS）的表达，进而抑制肝脏中三酰甘油（TG）和脂肪酸的合成[15]。沉默信息调节因子1（SIRT1）在 NAFLD的脂质代谢过程中发挥着至关重要的作用，其可激活PGC-1α的去乙酰化，从而间接诱导脂肪酸的β-氧化，进而降低肝脏中TG水平[16]。目前，桑根酮C是否可通过PPARα信号通路发挥治疗NAFLD的作用，尚不明确。

基于此，本课题组选择常用于研究NAFLD的人肝癌HepG2细胞[17]，并以游离脂肪酸诱导其发生脂质蓄积，进而探讨桑根酮C调节脂质代谢的作用及可能机制，以期为桑根酮C治疗NAFLD提供实验依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器有MEGAFMGE2.0R型低温高速离心机（德国Hermle公司），TissueLyser LT型中低通量组织研磨器（德国Qiagen公司），VCX750型超声波细胞破碎仪（美国SONICS公司），164-5056型蛋白电泳仪及转膜仪、SmartSpecTM Plus型核酸蛋白测定仪、CFX96TM型实时荧光聚合酶链式反应（PCR）扩增仪（美国 Bio-Rad公司），BX53型荧光倒置显微镜（日本Olympus公司），RT-2100C型酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），Tanon 2500R型全自动化学发光成像仪（上海天能生命科学有限公司）。

1.2 主要药品与试剂

本研究所用主要药品与试剂有桑根酮C（成都克洛玛生物科技有限公司，批号CHB190106，纯度98%），非诺贝特（美国APExBIO公司，批号B1943，纯度98%），油酸、棕榈酸（上海源叶生物科技有限公司，批号分别为S30037、S30008），牛血清白蛋白（BSA，广州威佳科技有限公司，批号0219989625），油红O染色试剂盒、MTT试剂（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为G1262、M8180），DMEM培养基、胎牛血清（美国Gibco公司，批号分别为1972985、1803122），TG试剂盒（南京建成生物科技有限公司，批号A110-1-1），TRIzon总RNA提取试剂、BCA蛋白定量试剂盒、RIPA裂解液（北京康为世纪生物科技有限公司，批号分别为CW0580、10243、CW2333S），逆转录试剂盒、SYBR? Green Premix实时荧光定量扩增试剂盒（艾科瑞生物有限公司，批号分别为AG11701、AG11711），兔源PPARα单克隆抗体、兔源CPT-1单克隆抗体、兔源SREBP-1c单克隆抗体、兔源FAS单克隆抗体、兔源SIRT1单克隆抗体、兔源PGC-1α单克隆抗体、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（美国Affinity Biosciences公司，批号分别为AF5301、DF12004、AF6283、AF5342、DF6033、AF5395、AF7021、S0001），ECL化学发光试剂（美国Millipore公司，批号1808501）;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（序列和产物长度信息见表1）;其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。

1.3 细胞株

本研究所用人肝癌HepG2细胞株，受赠于广州中医药大学中药学院药剂课题组。

2 方法

2.1 细胞培养

将HepG2细胞复苏后，以含10%FBS和1%青链霉素的DMEM培养基（以下简称“完全培养基”）于37 ℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。待细胞融合度达80%～90%时，以胰酶消化传代，进行后续实验。

2.2 细胞存活率的检测

取对数生长期的细胞，按1.5×104个/孔接种于96孔板中，然后分为桑根酮C不同浓度组（2、4、8、16、32        μmol/L，浓度根据预实验结果设置），加入含相应药物的完全培养基。另设不加药物只加细胞的对照组、不加细胞和药物的调零孔，每组设6个复孔;培养24 h后，每孔加入MTT 试剂20 μL，孵育4 h，弃去上清液;每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振摇15 min，采用酶标仪于490 nm波长下检测各孔的吸光度（A），计算细胞存活率[细胞存活率=（A实验组-A调零孔）/（A对照组-A调零孔）×100%]。

2.3 细胞分组、造模与给药

取对数生长期细胞，按2 ×105个/孔接种于6孔板中，然后分为对照组、模型组、非诺贝特组（10 μmol/L，浓度参考文献[18]设置）和桑根酮C低、中、高浓度组（2、4、8  μmol/L，浓度根据预实验结果设置）。参照文献[19]方法，对照组加入含1%BSA的完全培养基，模型组加入含1 mmol/L游离脂肪酸（将适量油酸和棕榈酸以含1%BSA的完全培养基溶解配制而成，以诱导脂质蓄积模型）的完全培养基，给药组加入含相应药物和1 mmol/L游离脂肪酸的完全培养基，然后培养24 h。

2.4 细胞中脂质蓄积情况观察和脂质水平测定

取对数生长期的细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，以PBS洗涤2～3次，加入固定液固定20～30 min;弃去固定液，水洗后加入60%异丙醇浸染5 min;弃去异丙醇，加入油红O染色液（临用时配制）浸染10～20 min;弃去染色液，水洗直至无多余染液，再加入苏木素染色液复染1～2 min;弃去苏木素染色液，水洗，取部分于显微镜下观察细胞中脂质蓄积情况，并拍照记录。观察结束后，每孔加入异丙醇200 μL，振摇15 min以充分洗脱;将洗脱液依次加入96孔板中，采用酶标仪于490 nm波长下检测A值（A值越大，则表示细胞中脂质水平越高）。

2.5 细胞中TG含量的测定

取对数生长期细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，采用超声波细胞破碎仪破碎细胞，然后收集细胞均浆液，采用BCA法测定细胞中蛋白浓度，并按照TG试剂盒说明书相关方法检测细胞中TG含量。

2.6 细胞中PPARα通路相关基因的mRNA表达水平的检测

采用实时荧光定量PCR法进行检测。取对数生长期细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，采用TRIzol法提取各组细胞的总RNA，然后根据试剂盒说明书相关方法，将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。反应体系为：cDNA模板2 μL，2×SYBR? Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNase free water 7 μL。反应条件为：95 ℃，30 s;95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40个循环。以GADPH为内参，采用2-ΔΔCt法计算PPARα、CPT-1、SREBP-1c、FAS、SIRT1、PGC-1α的mRNA表达水平。

2.7 细胞中PPARα通路相关蛋白表达水平的检测

采用Western blot法进行检测。取对数生长期细胞，按2×105个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，弃去培养液，以PBS洗涤2～3次，加入适量RIPA裂解液提取总蛋白，并置于冰上充分裂解30 min后于4 ℃条件下以12 000 r/min离心15 min;取上清液采用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经煮沸变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳;转膜，以5%脱脂奶粉封闭2 h;加入PPARα一抗（稀释度为1 ∶ 1 000）、CPT-1一抗（稀释度为1 ∶ 1 000）、SREBP-1c一抗（稀释度为1 ∶ 800）、FAS一抗（稀释度为1 ∶ 800）、SIRT1一抗（稀释度为1 ∶ 800）、PGC-1α一抗（稀释度为1 ∶ 800）、GAPDH一抗（稀释度为1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育过夜;以TBST缓冲液洗膜10 min×3次，加入二抗（稀释度为1 ∶ 3 000），室温孵育2 h;以TBST缓冲液洗膜10 min×3次，加入ECL化学发光试剂，采用全自动化学发光成像分析仪成像。采用Image J 6.0软件进行分析，以目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。

2.8 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，结果以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析;组间两两比较时，若方差齐则采用最小显著性差异法（LSD），若方差不齊则采用Dunnetts T3多重比较。检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 桑根酮C对HepG2细胞存活率的影响

与对照组比较，桑根酮C 16、32 μmol/L组细胞存活率显著降低（P<0.01），详见表2。因此，本研究选取对细胞活性无明显影响的2、4、8 μmol/L桑根酮C进行后续实验。

注：与对照组比较，**P<0.01

Note： vs. control group，**P<0.01

3.2 桑根酮C对HepG2细胞中脂质蓄积和TG含量的影响

与对照组比较，模型组细胞的细胞核（镜下显蓝色）明显萎缩、体积变小，脂滴数（镜下显红色）明显增加，细胞中脂质水平和TG含量均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，桑根酮C各浓度组和非诺贝特组细胞的细胞核萎缩不明显、体积大小正常，脂滴数明显减少，细胞中脂质水平和TG含量均显著降低（P<0.05），详见表3、图2。

3.3 桑根酮C对HepG2细胞中PPARα通路相关基因mRNA表达的影响

与对照组比较，模型组细胞中PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α 的mRNA表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），SREBP-1c、FAS 的mRNA表达水平均显著升高（P<0.01）;与模型组比较，桑根酮C各浓度组和非诺贝特组细胞中PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α 的mRNA表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），SREBP-1c、FAS的 mRNA表达水平均显著降低（P<0.01），详见表4。

3.4 桑根酮C对HepG2细胞中PPARα通路相关蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组细胞中PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α的蛋白表达水平均显著降低（P<0.01），SREBP-1c、FAS的蛋白表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01）;与模型组比较，桑根酮C各浓度组和非诺贝特组细胞中PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α的蛋白表达水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），SREBP-1c（桑根酮C低浓度组除外）、FAS的蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01），详见图3、表5。

4 讨论

NAFLD被认为是代谢综合征在肝脏的一种表现形式，其发病机制较为复杂，主要包括胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、炎症反应失调等[20]。目前较为公认的发病机制是“多次打击学说”，即以胰岛素抵抗为主的肝脏脂肪变性为“第一次打击”，以肝细胞内过氧化应激、内质网应激、肠道衍生内毒素、炎症级联反应等为“第二次打击”，以肝脏免疫紊乱导致肝纤维化、肝细胞缺血坏死和肝硬化为“第三次打击”[21]。由此可见，肝脏脂质代谢紊乱引起的肝细胞内脂质沉积（尤其是TG过多聚积）是导致NAFLD的主要原因[22-23]。现有的建立NAFLD模型的细胞主要包括原代肝细胞、永生细胞系、诱导多能干细胞等，其中永生细胞系具有生长稳定、无限寿命、表型稳定、培养条件比原代肝细胞简单、易于在不同实验室间标准化等优点[17]，因此本研究选择永生细胞系的人肝癌HepG2细胞进行研究。

本研究以游离脂肪酸诱导HepG2细胞发生脂质蓄积，以探讨桑根酮C对NAFLD脂质代谢的改善作用及相关机制。结果显示，HepG2细胞经1 mmol/L 游离脂肪酸诱导24 h后，细胞中脂滴数明显增加，脂质水平、TG含量均显著升高，表明脂质蓄积模型复制成功;经桑根酮C干预后，细胞中脂滴数明显减少，脂质水平、TG含量均显著降低，表明桑根酮C可减少HepG2细胞的脂质蓄积。

肝脏中脂质代谢离不开多种关键酶与蛋白的相互作用。研究表明，PPARα通路在控制脂肪酸转运与氧化、脂质合成和分解等代谢过程中具有重要作用[23]。本研究结果显示，经游离脂肪酸诱导后，HepG2细胞中PPARα、CPT-1、SIRT1、PGC-1α的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，SREBP-1c、FAS的mRNA和蛋白表达水平均显著升高;经桑根酮C干预后，细胞中上述指标均显著逆转（桑根酮C低浓度组的SREBP-1c蛋白除外），表明桑根酮C能激活PPARα途径、提高肝细胞的脂质氧化能力、减少细胞中的脂质合成，从而减轻脂质蓄积。

综上所述，桑根酮C可改善HepG2细胞的脂质蓄积;其作用机制可能与调节PPARα信号通路、提高细胞脂质氧化能力、抑制脂质合成有关。

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（收稿日期：2021-04-16 修回日期：2021-06-05）

（编辑：唐晓莲）