食管癌长非编码RNA与肿瘤干细胞的研究进展

龚小林综述 谢宇杰，王茂生审校

1.广东医科大学，广东 湛江 524000；2.高州市人民医院胸外科，广东 茂名 525200

食管癌是世界上发病率第七、癌症死亡率第六的一种常见恶性肿瘤，每20例癌症患者死亡，就有一例死于食管癌，它主要集中在东亚与南非的高发病的国家中[1]。食管癌在我国的发病率及死亡率明显升高，我国的食管癌患者占全球一半以上，其中发病率居第六，癌症死亡率居第四[2]。我国食管癌与西方国家的病理类型差异较大，西方国家以食管腺癌为主，而在我国食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)占据食管癌发病率的90%以上。食管癌的5年生存率仅为15%～20%，它的预后与肿瘤的分期相关[3]。早期食管癌以手术治疗为主，但多数食管癌发现时多为局部晚期患者，首选治疗方法是新辅助放化疗(nCRT)，然后是根治性手术。遗憾的是，大约20%的患者根本不会有病理反应，超过50%的患者没有充分的病理反应，甚至大多数患者发生病理完全反应后，会出现早期复发和远处转移[4]。而导致肿瘤复发转移的重要原因是存在于肿瘤内的极少数细胞，这些细胞具有无限增殖、自我更新及多向分化潜能，它们是肿瘤无限增殖、复发和转移的根源。此概念的提出为研究食管癌的发生与发展提供了一个新的视野，因此，研究具有更高治疗抗性和转移潜能的细胞亚群更为重要，即所谓的肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)。

近年来，长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)被普遍定义为超过200个核苷酸的非蛋白编码RNA分子，在世界各地得到了广泛的研究[5]。lncRNA是一组新的非编码RNA，位于细胞核或胞浆组分中，被发现是机体生理和病理过程的重要调节因子，特别是在癌症中。到目前为止，已经通过高通量技术鉴定了5 000多个人类lncRNA[6]。lncRNA被报道参与了恶性肿瘤的多种生物学行为，包括促进细胞增殖、细胞迁移与转移[7]、细胞凋亡[8]、细胞周期及化疗耐药性等[9]。LncRNA已被报道与食管癌的多种恶性生物学行为相关，其中也包括与食管肿瘤干细胞的相关行为。

1 与食管癌相关的肿瘤干细胞恶性生物学行为

目前已知食管癌肿瘤干细胞参与了食管癌的多种恶性生物学行为，总体而言，肿瘤干细胞被认为是肿瘤中的小部分细胞，但它们主要是负责肿瘤的自我更新、转移能力和治疗耐药性等，由于其特定的形态学和生物学特征，它们往往对治疗产生耐药性，进而导致肿瘤的转移和复发。另一方面，多项研究表明上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EΜT)与肿瘤干细胞间存在多种联系。当EΜT在癌症中异常激活时，细胞获得了有助于自我更新能力的干细胞属性，并且能够分化为肿瘤中的所有细胞类型。由此产生的即癌症干细胞具有癌症的各种恶性生物学特征，包括永生性复制、抵抗凋亡、侵袭性增加等[10]。此外，肿瘤干细胞模式认为化疗后剩余的肿瘤细胞具有更强的再生能力，放化疗被认为是一个富集肿瘤干细胞的过程。肿瘤干细胞通过多种分子机制，如药物外排泵的上调，或增强对ROS93-97的保护等，进而采取一种静止状态成为放化疗抵抗的重要原因[11]。

2 lncRNA调节食管癌的EMT与转移

上皮细胞-间充质转化是指上皮向间充质状态的转变，在这个过程中，细胞表达的黏附分子改变，进而增加了迁移和侵袭能力。目前已有研究表明，靶向lncRNA抑制EΜT有望抑制恶性肿瘤的发生、发展；lncRNA LBX2-AS1高表达于食管癌组织中，并通过促进肿瘤EΜT增加食管癌的恶性生物学特征[12]。另外，lncRNA NΜR高表达于ESCC组织中，作为ESCC肿瘤转移和耐药性的关键调节因子，它的上调与肿瘤转移有关，并与ESCC患者的整体生存率较差相关。在体外功能实验方面，NΜR能促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，抑制顺铂诱导的细胞凋亡，提高ESCC细胞的耐药性[13]。有研究表明通过沉默LncRNA-ECΜ的表达能够显著降低食管癌细胞系TE-1和Eca109细胞的侵袭和转移，而LncRNA-ECΜ的过度表达促进了两种细胞系的侵袭和转移[14]。敲除FTH1P3可显著降低ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，沉默FTH1P3可降低食管癌细胞系EC9706和EC1中特异性蛋白1(SP1)和NF-κB(P65)的表达[15]。ESCC的另一抗癌基因，lncRNA LINC00675通过抑制Wnt/β-catenin信号抑制肿瘤的启动发生和EΜT[16]。另一项研究中，研究者发现lncRNA RP11-766N7.4在ESCC组织和细胞系中表达下调，与淋巴结转移、肿瘤的分期和患者生存等相关。功能实验研究也表明，lncRNA RP11-766N7.4通过抑制EΜT的过程从而抑制食管癌细胞迁移和转移[17]。

研究表明lncRNA SOX2OT在肿瘤的发生和进展以及调节干细胞的多能性状态起着重要作用[18]。高lncRNA-HOTAIR表达与食管癌患者的整体生存显著相关，体外实验表明lncRNA-HOTAI增加了食管癌细胞增殖、侵袭和迁移，并促进了EΜT。分子机制相关的研究显示lncRNA-HOTAIR与mir-148构成海绵结构，从而调节Snail2的表达，最终促进EΜT[19]。

3 lncRNA调节食管癌的放化疗耐性

目前有研究表明lncRNA TUSC7的过度表达，调控miR-224的低表达从而抑制了ESCC细胞的增殖、克隆形成和化疗耐药，最终促进了癌细胞凋亡。另外，该研究也证实了miR-224与DESC1特异结合，与DESC1的表达呈负相关。TUSC7通过抑制miR-224增加DESC1的表达，从而抑制ESCC细胞的增殖和化疗耐药，信号通路的研究也表明了DESC1通过EGFR/AKT信号通路抑制了ESCC细胞的化疗耐药[20]。

此外，WISP1已被证明与ESCC肿瘤细胞中的EΜT表型密切相关，并作为食管鳞状细胞癌放射治疗的独立预后因素。该研究表明WISP1是逆转食管鳞状细胞癌EΜT相关的放射治疗抵抗的一个关键治疗靶点，可以作为食管癌放疗患者的独立预后因子[21]。

lncRNAAFAP1-AS1的高表达预测了经放化疗治疗的ESCC患者的放化疗耐性和不良预后[22]，因此可作为放化疗的食管鳞癌预测标志物。

此外，一项研究使用Kaplan-Μeier生存分析显示，lncRNA LOC285194低表达患者的无病生存率(DFS)(P＜0.001)和总生存率(OS)降低(P＜0.001)。进一步的多变量分析确定该分子为多变量独立预后风险因子(P=0.001)。它的表达降低与食管鳞状细胞癌放化疗耐药及预后不良的密切相关[23]。

食管癌细胞中lncRNA linc-VLDLR和ABCG2基因的高表达影响食管癌耐药的形成，研究表明耐药细胞释放的细胞外囊泡可上调食管癌细胞ABCG2的表达，从而调节食管癌细胞的耐药性，这与细胞外囊泡携带的linc-VLDLR有关[24]。

4 食管癌lncRNA与肿瘤干细胞研究相关的实验技术

鉴定ESCC组织中lncRNA的异常表达对于研究lncRNA在ESCC中的作用具有重要意义。定量实时PCR(Q-PCR)是检测ESCC组织中异常lncRNA表达的经典方法[25]。近年来，现有的下一代测序(NGS)技术为研究人员提供了更完整的ESCC肿瘤与正常组织之间的lncRNA表达谱。例如，WANG等[26]用NGS技术检测ESCC患者肿瘤及邻近正常组织中402个上调和741个下调的lncRNA。

此外，在肿瘤基因组图谱(TCGA)的分析中，发现了食管癌两种主要组织学类型之间存在显著不同分子变化的多种遗传改变模式。在食管腺癌中，ERBB2、VEGFA、GATA4和GATA6的表达失常可能比ESCC更频繁。相反，在ESCC中，mTOR信号通路基因PIK3ca/AKT和PTEN、TP63/SOX2扩增和Notch1突变的改变更频繁[27]。TCGA分析可用于ECCS的表达鉴定和验证其潜在的新的生物标志物。

成球能力鉴定是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法，其测定的是肿瘤细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力，一般使用低黏附的培养板防止细胞贴壁，结合使用无血清的培养基(加入B27和合适浓度的生长因子等添加剂，各种肿瘤报道的不尽相同，需要参考相关文献)，以及使用1%浓度的甲基纤维素抑制细胞聚集，以确保一个细胞球来源于单个细胞等。目前该方法已经在多种肿瘤干细胞的研究中得到应用[28]。

通过移植特定的细胞群，裸鼠肿瘤细胞移植，是检测肿瘤干细胞的启动能力的体内实验，也是检测肿瘤干性的重要实验[29]。

机制研究方面，有关调节lncRNA可以通过碱基配对相互作用来调节miRNA的活性，这种lncRNA是一种称为竞争性內源RNA(competing endogenouse RNAceRNA)的调节模式[30]，有研究表明长非编码RNAPCAT1是一种新的基于血清的生物标志物，通过海绵状mir-326在食管鳞状细胞癌中促进细胞生长[22]。

另一方面，与mRNA相结合的通路研究也见报道。信号通路研究表明，FΜR1-AS1可与TLR7相结合，从而维持ESCC干细胞的特性，并激活下游TLR7/NF-κB信号，促进c-myc的表达，从而诱导ESCC细胞增殖、抗凋亡和侵袭能力。外显子孵育和共移植试验表明，FΜR1-AS1外显子可能从ESCC中分泌，在肿瘤微环境中将干细胞表型转移到非肿瘤干细胞中[31]。

5 小结

人类目前对于lncRNA的理解还只是冰山一角，随着高通量测序等技术的成熟，越来越多的lncRNA被发现与研究，包括与食管癌的发生、发展、耐药性等，其中重要的一点便是食管肿瘤干细胞相关性研究。肿瘤干细胞(CSC)的概念是在四十年前提出的，并指出肿瘤生长类似于健康组织的更新，是由少量的特指干细胞推动的。肿瘤干细胞理论对肿瘤发生与发展过程提出新的理论，这一点已逐渐证实了许多肿瘤都藏匿着干细胞，然而肿瘤干细胞的鉴定和针对肿瘤干细胞的治疗方法等方面还没有得到证实。本文总结了lncRNA在食管癌肿瘤干细胞相关的发生、发展及相关研究方法，阐述了它们在其中的潜在分子机制。目前，越来越多的lncRNA被确定为包括食管癌在内的各种肿瘤的生物标志物或潜在治疗生物靶点，但人类对于lncRNA与肿瘤干细胞的相关调控还不清晰，未来应当加深对lncRNA在肿瘤干细胞领域潜在机制的研究，这将有助于发现食管癌的新型诊断和治疗方法。