伏马毒素的理化性质、检测方法及在我国玉米和玉米制品中的污染现状综述
2021-12-09赫丹徐剑宏剑波刘馨史建荣LEEYin-Won
赫丹 徐剑宏 剑波 刘馨 史建荣 LEE Yin-Won
摘要:伏马毒素是广泛存在于霉变玉米、高粱、水稻等谷物及其制品中的一种霉菌毒素,具有神经毒性、致癌性等毒副作用。摄入伏马毒素污染的粮谷或饲料均会带来严重的健康问题。近年来,粮谷食品质量安全问题中霉菌毒素的污染问题最为突出。我国针对饲料中的霉菌毒素制定了相应的限量标准,但暂时未对食品中的伏马毒素进行限量,且国际上伏马毒素的限量标准也并不完全统一。就伏马毒素的理化性质、限量标准和检测方法等方面进行了综述,并对近年来我国玉米及其制品中伏马毒素的污染现状进行了总结讨论,旨在为我国粮谷中伏马毒素限量标准的制定、风险监测和管控提供参考。
关键词:伏马毒素;限量标准;污染现状;检测方法;玉米及其制品;农产品质量安全
中图分类号:TS207.5 文献标志码: A
文章编号:1002-1302(2021)21-0033-07
收稿日期:2021-03-02
基金项目:国家自然科学基金(编号:31872914、31901805);国家重点研发计划(编号:2018YFE0206000);西藏自治区重点研发计划(编号:XZ202001ZY0038N)。
作者简介:赫 丹(1990—),女,河北石家庄人,研究实习员,主要从事农产品质量安全与营养相关研究。E-mail:danhe58@163.com。
通信作者:史建荣,博士,研究员,主要从事农产品质量安全方面与营养相关研究。E-mail:shiji@ jaas.ac.cn。
伏马毒素(fumonisins,简称FBs)又称烟曲霉毒素,是串珠镰刀菌(Fusarium monitiforme)、轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)等在一定温度、湿度下产生的次级代谢产物,极易侵染玉米、高粱、水稻等粮谷类作物,在玉米中浸染最为普遍,也相对严重[1]。食用被伏马毒素污染的粮谷或饲料会对人和动物产生不同程度的健康危害。伏马毒素B1是鞘氨醇(sphingosine,简称So)和二氢鞘氨醇(sphinganine,简称Sa)的结构类似物,可竞争性结合神经酰氨合成酶,导致So和Sa的大量累积,从而减少复合鞘氨醇酯的合成,临床上常用尿液、血液或器官组织中Sa含量/So含量的值升高作为FB1中毒的生物标记[2-3]。它的毒性主要包括神经毒性、免疫毒性、生殖毒性、器官毒性和致癌性。它对啮齿类动物主要以肝脏和肾脏的毒素性为主,可引起马脑白质软化症(equine leukoencephalomalacia,简称ELEM)和猪肺水肿,且与人類的食管癌、神经管型缺陷病也有一定的关系[4-5]。研究者表示伏马毒素和黄曲霉毒素1(具有基因毒性和致癌性)之间可能存在一定的相互作用,具有诱导再生细胞的增殖潜力[6]。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer,简称IARC)对伏马毒素B1进行了评估,并将其评定为2B级致癌物[7]。本文在综述伏马毒素理化性质、国内外限量标准和检测方法的基础上,进一步对近年来我国玉米及其制品中伏马毒素的污染现状进行总结与讨论,以期为我国粮谷中伏马毒素限量标准的制定、风险监测和管控提供参考依据。
1 伏马毒素的理化性质和限量标准
1.1 理化性质
伏马毒素是一种由多氢醇和丙三羧酸组成的结构类似的双酯化合物,包括1个由20个碳原子组成的脂肪链及通过2个酯键连接的亲水性侧链[8],其化学结构式见图1。伏马毒素最早是由Gelderblom等于1988年研究南非人口中食道癌的发生率时发现的[9]。目前,已发现的天然伏马毒素共有28种不同的异构体,可分为4种类型,分别为FA、FB、FC和FP,主要以伏马毒素B族(简称FB)的形式存在。自然污染的情况下,FB1的污染最为广泛,约占粮食污染中伏马毒素的60%以上,毒性也最强,其中FB1、FB2和FB3含量的比例约为 12 ∶4 ∶1[1,10]。粮谷中伏马毒素除了以上述游离形式存在外,还有很多隐蔽形式,如伏马毒素在酸性环境中易水解,失去1个或2个丙三羧酸基团,从而形成水解伏马毒素或部分水解伏马毒素;通过与糖分子结合,从而形成伏马糖苷;被脂肪酸酯化,形成脂肪酰伏马毒素;此外,还可以与蛋白质共价结合[11-13]。
伏马毒素的纯品为白色针状晶体,无紫外吸收和荧光特性,易溶于甲醇、乙腈和水。它在甲醇中不稳定,可降解成单甲酯或双甲酯,但在-18 ℃下可稳定保存6周;在酸性条件中可水解成水解伏马毒素,且其水解产物一样具有一定的毒性[14]。它在乙腈-水(体积比1 ∶1)中稳定,25 ℃下可保存6个月;在pH值为3.5和9的缓冲液中,78 ℃下可保存16周。有报道表明,伏马毒素在多数的食品加工过程中较为稳定,于100 ℃蒸煮30 min也不能破坏其结构,需在175 ℃下加热60 min才能使90%的伏马毒素降解[15]。
1.2 限量标准
1.2.1 食品中伏马毒素的限量标准
目前,我国尚未制定食品中伏马毒素的限量标准,国际上对食品中伏马毒素的限量也无统一标准。只有部分组织、国家对食品中伏马毒素的限量标准作出了较为详尽的限定(表1)。联合国粮农组织和世界世卫组织食品添加剂联合专家委员会(FAO/WHO)将FB1、FB2和FB3总量的每日最大耐受摄入量定为 2 μg/(kg·d)[16-17]。对于食品中伏马毒素的限量,主要限制的是伏马毒素的总量,多数针对食用玉米及玉米制品,仅瑞士和法国制定了谷物及谷物制品中伏马毒素的限量标准。根据消费群体、加工工艺、制成品的不同,各国之间伏马毒素的限量标准差异较大,其中欧盟制定的食品中伏马毒素限量标准分类最为详尽,对婴幼儿玉米制品谷物中伏马毒素的限量最低,仅为200 μg/kg(表1)。
1.2.2 饲料中伏马毒素的限量标准
我国最新GB 13078—2017《饲料卫生标准》规定了部分饲料原料和饲料产品中的FB1和FB2总量的限量标准。其中饲料原料玉米及其加工产品、玉米酒糟类产品、玉米青贮饲料和玉米秸秆中伏马毒素的限量为 60 mg/kg,其他饲料产品中伏马毒素的限量在5~20 mg/kg[23]。
2 伏马毒素的检测方法
伏马毒素的检测方法主要有薄层色谱法(thin layer chromatography,简称TLC)、酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,简称HPLC)和液相色谱串联质谱法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,简称LC-MS/MS)。
薄层色谱法是真菌毒素的传统检测方法,20世纪被许多国家广泛运用[24],但由于操作繁琐、重现性差、灵敏度低,已逐步被其他方法取代,目前该方法常用来作为伏马毒素的制备、富集和提纯[25-26];酶联免疫吸附测定法一般采用竞争ELISA的原理,通过与标准曲线对比,对伏马毒素进行定性或定量分析,该方法具有准确、快速、灵敏度高和特异性好等特点,经常作为快速检测方法,广泛应用于大批量样品的初筛和现场检测等。
高效液相色谱法因其操作方便、灵敏度高、稳定性好等优点,是目前国内外常用以检测伏马毒素的定量检测方法之一。由于伏马毒素本身并没有特定的紫外吸收性,也不具备荧光特性,所以在使用HPLC分析前,须要先将伏马毒素与衍生化试剂进行衍生,使其获得荧光特性后,方可进行HPLC检测。目前,伏马毒素的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛(o-phthalaldehyde,簡称OPA)、9-芴代甲氧苯酰氯、萘-2,3-二甲醛(NDA)、丹磺酰氯及6-氨基喹啉-N-羟基琥珀等,其中以OPA衍生的灵敏度最高,也最为常用[27]。但OPA衍生产物的荧光强度随着时间延长逐渐降低,对衍生反应时间要求相对较严格,须要在衍生反应后2 min内进样。Kaltner等建立了一种基于SAX柱净化的反相液相色谱荧光检测玉米中FB1和FB2的方法,该方法对FB1和FB2的检出限分别为29.2、17.5 μg/kg,回收率在79.4%~98.0%之间[28]。Smith等采用9-芴代甲氧苯酰氯(FMOC-Cl)进行柱前衍生,使用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FID)检测了饲料中的伏马毒素1和伏马毒素2,检出限为 0.002 5 μg/mL,精密度为1.0%~16.7%,当加标浓度在0.1~30.0 μg/kg时,回收率为75.1%~115.2%[29]。
液相色谱-串联质谱法一般采用电喷雾正离子和多反应监测模式对伏马毒素进行检测,和液相色谱不同,它不需要对伏马毒素进行衍生化,且具有更高的检测灵敏度、重现性和准确度,可以同时检测游离伏马毒素和隐蔽型伏马毒素[30]。由于粮谷中的伏马毒素在酸性环境下易水解成水解伏马毒素或部分水解伏马毒素,且可与样品中的蛋白质或脂质等共价结合成三羧基伏马毒素、脂肪酰伏马毒素等。这些隐蔽伏马毒素的毒性虽然尚不明确,但在动物肠道内有可能会转化成游离伏马,所以粮谷中隐蔽伏马毒素检测方法的建立对伏马毒素的膳食风险评估具有重要的意义。但隐蔽型伏马毒素的形态具有多样性,单独分开检测工作较为烦琐,所以一般在提取的过程中,采用碱水解的办法,将游离伏马毒素和隐蔽伏马毒素全部水解成水解伏马毒素后用LC-MS/MS进行检测分析[12,31]。Brya 等采用同位素内标稀释法建立了玉米及其制品中游离伏马毒素(FB1、FB2和FB3)和水解型伏马毒素(HFB1、HFB2和HFB3)的液质联用的检测方法,方法的定量限在12.5~22.0 μg/kg 之间,加标浓度在200~800 μg/kg时,方法回收率为82%~111%[32]。
3 我国玉米及其制品中伏马毒素的污染现状
伏马毒素主要存在于粮谷中,以玉米及其制品中最为普遍,但在以粮谷为原料的一些产品中,也时有报道。如表2所示,近年来随着检测技术的不断发展,人们对伏马毒素的关注度逐渐提高,由原来单一的伏马毒素1逐渐转向了对伏马毒素总量的关注,并且对隐蔽伏马毒素毒性和污染的研究也越来越广泛;部分玉米样品中FB1的含量高达 10 000 μg/kg 以上,远高于欧盟食用玉米的最高限量 4 000 μg/kg,除了常见的游离伏马FB1、FB2、FB3外,FB4和隐蔽伏马毒素均有被检出的情况,具有较高的食用风险。
伏马毒素主要污染玉米及其制品,孟繁磊等检测了吉林省内采集的50份玉米样品中的FB1和FB2,其中42个样品中检出FB1,检出率为84.0%,污染水平在151.12~805.6 μg/kg之间[33]。Liu等对我国贵州、河北、内蒙等8个省份抽取的共249份玉米样品中的伏马毒素进行了检测,中FB1和FB2的检出率分别为66.7%和51.0%,最大值分别为 10 315、5 209 μg/kg,平均值为530、288 μg/kg[34]。Xing等对山东、河北、河南3省的44份基地玉米样品中的伏马毒素进行了测定,伏马毒素1的检出率为100%,最大值为315.9 μg/kg,平均值为116.5 μg/kg[35]。
玉米粉、玉米糁、玉米面等玉米制品中均有伏马毒素的检出(表3)。Yang等对我国安徽、河北、河南、江苏、浙江等5个省份抽取的576份玉米及玉米制品样品(203份玉米、80份玉米粉、86份玉米糁、207份玉米面)中的伏马毒素(FB1、FB2、FB3)检测的结果表明,其中FB1、FB2和FB3的最大值分别为9 845、2 307、1 090 μg/kg。玉米粉中的FB1污染最为严重,检出率达95%,平均值为 592 μg/kg。玉米制品污染程度从高到低分别为玉米粉、玉米糁、玉米面、玉米[37]。张梦妍等对河北省2014年抽取的80份玉米面样品中的FB1和FB2进行了测定,其中未检出FB2,FB1检出样品9份,检出率为11.25%,最大值为23.32 μg/kg,平均值为 1.14 μg/kg[36];Jiang等对山东省的玉米基的窝窝头(41份)、馒头(11份)、薄的玉米煎饼(8份)和玉米饼(30份)中的伏马毒素进行测定,上述玉米制品中FB1、FB2和FB3的检出率分别为94.4%、78.9%和92.2%,最大值为1 775、141.6、70.64 μg/kg,平均值为121.10、7.76、5.06 μg/kg[38]。
除游离型伏马毒素外,玉米及其制品中隐蔽伏马毒素潜在的污染风险同样不可忽视,特别是霉变玉米,具有较高的污染风险(表3)。Hu等对我国山东省采集的20份自然晾干的玉米样品(10份发霉、10份不发霉)以及从浙江省超市采集的38份玉米制品样品(新鲜玉米粒12份和冷冻的玉米粒4份、玉米淀粉6份、玉米片4份、玉米糁8份和玉米粉4份)采用LC-MS/MS对游离型伏马毒素(FB1、FB2)和水解伏马毒素(HFB1、HFB2)进行了测定,结果发现所有玉米及其制品样品中均有伏马毒素的检出。其中发霉的干玉米、正常干玉米、玉米片、玉米糁和玉米粉中的FB1、FB2、HFB1和HFB2的检出率均为100%,4个冷冻玉米样品中仅有1个样品有HFB1检出,其他伏马毒素均未检出。检出率由高到低分别为干玉米(玉米片、玉米糁、玉米粉)、新鲜玉米、玉米淀粉、冷冻玉米。其中霉变干玉米中4种伏马毒素的平均值均在13 706 μg/kg以上,HFB2的平均值最高(4 343 μg/kg),已经超出欧盟对食用玉米4 000 μg/kg的限量。除霉变干玉米外,其他玉米制品中FB1、FB2、HFB1和HFB2的最大值分别为2 993、764、7 226、1 211 μg/kg,存在一定的食用風险。FB1的污染程度由高到低分别为霉变干玉米、玉米片、玉米粉、玉米糁、干玉米、玉米淀粉、鲜玉米、冷冻玉米[43]。
同样,国外玉米及其制品中伏马毒素污染情况也时有报道。Hanvi等对多哥的55份玉米样品中的伏马毒素进行了测定,结果显示FB1、FB2和FB3的检出率分别为48%、30%和14%,最大值分别为1 838、586.4、185.6 μg/kg,阳性平均值分别为504.8、176、82 μg/kg[40]。对埃塞俄比亚的100份玉米样品4种中伏马毒素含量的研究结果表明,FB1、FB2、FB3、FB4的检出率分别为70%、61%、51%、60%,最大值分别为11.831、3.732、1.603、1.364 mg/kg,平均值分别为0.606、0.202、0.136、0.085 mg/kg[44]。Hove等对津巴布伟的95份玉米样品中的伏马毒素检测的结果表明,FB1、FB2和FB3的检出率分别为95%、31%和3%,最大值为1 106、334、67 μg/kg,阳性平均值为242、120、57 μg/kg[42]。Adekoya等2015—2016年对南非32份玉米原料的啤酒中的伏马毒素检测结果显示,FB1、FB2和FB3均有检出,检出率分别为53%、32%和6%,3种伏马毒素的最大值分别为182、143、37 μg/kg,阳性平均值为151、96、36 μg/kg[39]。
4 结论与展望
玉米及其制品伏马毒素的污染较为普遍,部分样品(发霉的干玉米)中FB1高达 10 mg/kg,HFB1含量高达50 mg/kg,远远高于欧盟对伏马毒素的最高限量标准(4 000 μg/kg),具有较高的食用风险。目前,我国虽然针对饲料原料中的玉米及其加工品中的伏马毒素制定了相关限量标准,但暂无粮谷等食品中伏马毒素的限量标准,而国际上对玉米等谷物食品中伏马毒素的限量主要在1 000~4 000 μg/kg之间,因而建立我国粮谷类食品中伏马毒素的限量标准迫在眉睫,一方面出于保护国内粮谷类食品的质量安全的需要,另一方面可进一步与发达国家的要求接轨,促进我国的进出品贸易。此外,监管部门应当加强对玉米及其制品中伏马毒素的监控,密切关注玉米等粮谷中伏马毒素的污染监测调查情况,为制定我国粮谷中伏马毒素的限量标准提供数据支撑与理论基础。
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