杧果PEPC基因家族全基因组鉴定及表达分析

彭文丽，刘照宇，李晓波，杨成坤

(1 海南省农垦科学院，海口，570311；2 海南大学园艺学院/热带作物新品种选育教育部工程研究中心，海口，570228)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC)是一种广泛分布于维管植物、细菌和藻类中的细胞质酶[1]，其主要功能是以Mn2+或Mg2+作辅助因子，催化HCO3-和磷酸烯醇式丙酮酸反应生成草酰乙酸和无机磷酸[2]，这一反应是景天酸代谢和C4代谢植物光合作用中同化和固定CO2的主要步骤。不同植物上的研究表明，PEPC基因在不同组织中还可能参与多个非光合作用的生物学过程[3]。如参与种子发育过程[4]；保持植物细胞离子平衡，调节气孔运动[5]；调节植物对生物及非生物胁迫的耐受性[6]；为豆科生物固氮过程提供碳骨架；参与调控植物种子营养物质的合成与代谢过程，控制糖类物质流向脂肪酸合成或蛋白质合成途径等作用[7]。也有研究指出，PEPC基因在果实成熟调控中也起到重要作用[8]。

目前，多种植物的PEPC家族基因已在全基因组水平被鉴定和研究。如拟南芥中鉴定出PEPC基因4个，水稻中为6个[9]，大豆[10]和菠萝[11]中分别报道了10个和3个等。根据PEPC基因和蛋白的结构，可将其分为植物型(plant-type PEPC，简称PTPC)和细菌型(bacterial-ype PEPC，简称BTPC)两种。PTPC常编码110kDa大小的蛋白质，基因中内含子9～10个，在N端具有保守的磷酸化作用位点；BTPC编码约117kDa大小的蛋白质，基因中内含子19～21个，N 端无磷酸化位点[9]。

杧果MangiferaindicaL.是世界第五大栽培水果[12]，也是我国华南地区农业的支柱产业之一。杧果营养丰富，风味独特，具有“热带水果之王”的美称，受到消费者青睐，研究其果实发育过程对提升杧果商品性具有重要意义[13]。目前，PEPC基因家族在杧果中鲜见报道。本研究对杧果PEPC家族进行全基因组鉴定，系统分析了杧果PEPC基因(简称MiPEPC)家族成员的理化性质、结构特征、系统发育等信息，并研究它们在不同杧果组织和不同品种杧果果实不同发育阶段的表达情况，研究结果可为进一步研究MiPEPC家族的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1MiPEPC基因家族的全基因组鉴定及蛋白特性分析

杧果基因组及注释数据下载于国家基因组数据中心[14](https：//bigd.big.ac.cn/search dbId=gwh&q=PRJCA002248)，拟南芥AtPPC家族序列下载于Uniprot数据库(https：//sparql.uniprot.org/)。利用拟南芥AtPPC基因家族成员序列进行BlastP比对到杧果所有蛋白序列，去冗余；然后进一步利用在线工具NCBI blastp(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对到swissprot数据库，去除近源基因；最后利用在线网站NCBI cd-search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和Pfam(http：//www.sanger.ac.uk/software/Pfam/)进行保守结构域分析，从而获得确定的MiPEPC基因家族成员，并重新命名为MiPEPC1～MiPEPC4。使用ExPASy(https：//www.expasy.org//)计算MiPEPCs蛋白的等电点，分子量和序列长度，预测不稳定指数、脂肪系数和平均亲水系数；使用Plant-mPLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)预测其亚细胞定位。

1.2MiPEPCs系统发育、保守结构域和保守基序分析

菠萝AnanascomosusL. PEPCs蛋白全长信息来自http：//pineapple.angiosperms.org，水稻PEPC蛋白全长信息来自http：//rice.plantbiology.msu.edu/。使用Clustal X程序分别对杧果、拟南芥、菠萝和水稻的PEPCs蛋白全长和保守结构域比对，再利用MEGA X对PEPC蛋白全长建NJ树，设置Bootstrap为1 000次，其他参数为默认值。利用NCBI cd-search和Pfam预测PEPC蛋白保守结构域，MEME-suite(http：//meme-suite.org/tools/meme)挖掘保守基序，最后TBtools绘制保守结构域，保守基序和系统发育树[15]。

1.3 染色体分布

利用杧果全基因组注释信息获取所有基因密度信息和MiPEPCs成员在染色体上的位置。

1.4 启动子—顺式作用元件分析

提取MiPEPCs基因5′端上游2 000 bp的序列作为候选启动子序列，利用PlantCare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站进行顺式作用元件分析。

1.5 转录组表达分析

下载已公开发表的杧果转录组数据，NCBI登录号分别为PRJNA48715[16]：样品为“阿方索”杧果成熟叶片、成熟树皮、种子、根、果皮、果肉和花；PRJNA629065[17]：样品为台农一号杧(高糖品种)和热农1号杧(低糖品种)不同发育阶段的果肉。使用Salmon软件[18]分析MiPEPCs在不同杧果转录组中的表达情况。

1.6 qRCR分析

在海南水果岛农业开发有限公司果树园区(三亚市崖州区)采集贵妃杧的根、树皮、成熟叶片、花和果实组织；于中国热带农业科学院果树资源圃采集红杧6号(高糖品种)果实，于海口市海岸路水果市场购买香杧(低糖品种)果实，在实验室清洗红杧6号香杧后，分离其果肉。上述每个样品重复3次，所有样品经液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

样品总RNA提取使用天根DP441(多糖多酚专用型)试剂盒，反转录和qPCR分别使用诺唯赞公司的HiScript III 1st Srand cDNA Synthesis Kit与ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒，操作流程按照使用说明书优化。引物设计使用在线网站Primer3(https：//primer3.ut.ee/)完成，内参基因使用杧果Actin基因，内参和目的基因引物信息见表1。相对定量计算使用2-ΔΔCt法，绘图使用origin 8.5软件。

表1 杧果MiPEPCs及内参基因引物信息

2 结果与分析

2.1MiPEPC基因家族鉴定和理化性质分析

基于杧果基因组文件和注释信息文件共提取出34 522条蛋白序列，筛选得到MiPEPCs家族成员4个，其中最短蛋白含氨基酸838个，最长蛋白含氨基酸1 076个。将MiPEPCs命名为MiPEPC1～MiPEPC4。

蛋白理化性质分析发现，MiPEPC家族蛋白的相对分子量范围为93 334.00～122 537.50，所有杧果MiPEPCs均为酸性蛋白(理论等电点<7)。不稳定指数分析发现，所有杧果MiPEPCs均为不稳定蛋白(不稳定系数>40)；脂肪系数范围87.29～90.75，且所有成员蛋白均为亲水蛋白(平均亲水系数<0)；亚细胞定位预测显示，所有成员都定位于细胞质(见表2)。

表2 杧果MiPEPC家族成员的基本信息

2.2MiPEPC家族系统发育、保守结构域和保守基序分析

系统进化分析发现，17个分别来自拟南芥、水稻、菠萝和杧果的PEPC蛋白可分为2个亚族。I亚族的成员仅有1个PEPcase保守结构域，为PTPC；II亚族的成员则有2个PEPcase保守结构域，为BTPC。MiPEPC1、MiPEPC2和MiPEPC3位于I亚族，MiPEPC4则被分到II亚族(见图1)。

将MEME预测的保守基序(Motif)和保守结构域联合分析发现，不同物种I亚族和II亚族的保守区域大部分都在保守结构域中，不同物种保守基序的种类和位置是十分相似，且I亚家族较II亚家族更为保守。根据保守基序的预测结果不难看出，尽管II亚家族成员被预测出两个PEPcase结构域，但其位于5′端的PEPcase结构域区域内的保守基序和I亚家族成员PEPcase结构域5′端的基序是相似的；而3′端的PEPcase结构域区域内的保守基序和I亚家族成员PEPcase结构域3′端的基序也具有一定相似性。这表明，II亚家族成员中的2个PEPcase原本可能是1个，可能是在进化过程中插入了基因片段而分离(见图1)。

图1 拟南芥、水稻、菠萝和杧果PEPCs蛋白系统进化树、保守结构域和保守基序

多序列比对结果也能说明这点，I亚家族的保守位点较II亚家族的保守位点更多，且I、II亚家族的PEPCs成员在II亚家族5′端的PEPcase结构域的3′端和3′端的PEPcase结构域区域的5′端高度不保守，这可能是插入的基因片段造成的(见图2)。

图2 拟南芥、水稻、菠萝和杧果PEPCs蛋白保守结构域的多序列比对

2.3MiPEPC家族基因结构

MiPEPCs基因结构分析显示，同属于I亚族的MiPEPC1、MiPEPC2和MiPEPC3基因结构较为相似，且这三者与MiPEPC4基因结构差异较大。MiPEPC2和MiPEPC3中均含10个外显子，9个内含子；MiPEPC1含11个外显子，10个内含子，且MiPEPC1、MiPEPC2和MiPEPC3的PEPcase保守结构域区域均含有8个内含子。MiPEPC4则含多达20个外显子，19个内含子，其两个PEPcase保守结构域区域共含有14个内含子(见图3)。

图3 杧果MiPEPCs基因成员结构

2.4MiPEPC家族染色体分布

染色体定位分析结果显示，MiPEPCs分布在5条不同染色体上，Chr10、Chr12、Ch16和Chr19上各含1个PEPC基因，其中MiPEPC2、MiPEPC3和MiPEPC4位于染色体上基因密度较高的区域，MiPEPC1所在区域基因密度较低(见图4)。

注：染色体颜色越红，该区域基因密度越高；颜色越蓝，该区域基因密度越低。

2.5MiPEPC家族顺式作用元件分析

启动子区顺式作用元件分析发现，去除未知功能元件和一般性转录调控元件(如TATA-box和CAAT-box等)后，共发现125个顺式作用元件，其中数量最多的是光响应元件，包括Box 4、GA-motif、MRE和G-box等，共有59个，占元件总数的47.20%。

对其他66个元件统计发现，这些元件分别涉及到植物激素响应、生长发育及生物与非生物胁迫响应。其中激素响应类元件共有46个，包括脱落酸响应元件(ABRE)、生长素响应元件(TGA-element和AuxRR-core)、乙烯响应元件(ERE)、茉莉酸响应元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和水杨酸响应元件(TCA-element)。生长发育相关元件共有5个，包括分生组织表达相关元件(CAT-box)和胚乳表达相关元件(GCN4_motif和AACA_motif)。生物与非生物胁迫类元件有15个，包括厌氧诱导元件(ARE)、低温响应元件(LTR)、干旱诱导元件(MBS)和创伤反应元件(WUN-motif)。杧果MiPEPCs启动子区域的顺式作用元件主要集中于激素响应类元件，其中MiPEPC2含6个脱落酸响应元件和8个茉莉酸响应元件，其表达可能较易受到这两种激素诱导(见图5)。

图5 杧果MiPEPCs家族启动子区域顺式作用元件分析

2.6MiPEPC转录组表达分析

杧果不同组织的表达分析发现，MiPEPC基因在阿方索杧不同组织中的表达具有偏好性，4个成员在7个组织(根、树皮、叶片、果皮、果肉、种子和花)中均有表达，但表达差异较大。MiPEPC1在根(TPM≈60.93)和花穗(TPM≈52.18)中高表达，在根中的表达量分别是MiPEPC2、MiPEPC3和MiPEPC4的12.91、9.62和1.82倍，在花穗中的表达量分别是MiPEPC2、MiPEPC3和MiPEPC4的15.53、2.53和8.52倍，在叶片、树皮、种子和果皮中也有相对较高的表达，在果肉中则相对低表达。MiPEPC2在种子中的表达量相对较高(TPM≈8.95)，在其他各组织中表达量相对较低。MiPEPC3在花穗(TPM≈20.65)、果皮(TPM≈28.58)和果肉(TPM≈23.58)中有较高表达；MiPEPC4则在花穗中低表达(TPM≈6.13)，在其他组织中较高表达(见图6)。表明杧果MiPEPCs在不同组织中可能承担不同的作用。

图6 MiPEPC基因在阿方索杧不同组织表达情况

高糖品种台农一号杧和低糖品种热农1号杧未熟(花后30 d)至完熟过程中的转录组表达分析显示，MiPEPC2在两个品种不同发育阶段果肉中均低表达，推测其可能与果肉发育的相关性不大。MiPEPC1、MiPEPC3在两个品种中有相似的表达模式，即在果实发育前期表达量低，而在果实发育后期高表达；且同一发育时期在台农一号杧中表达量显著高于热农1号杧。MiPEPC4在两个品种不同发育阶段果肉中表达量最高，且在不同品种中呈现出不同的表达模式，台农一号杧在果实完熟期时MiPEPC4高表达，热农1号杧在果肉发育中后期MiPEPC4高表达(见图7)。

注：T-Unripe、T-Early ripe、T-Patially ripe、T-Fully ripe为台农一号杧未成熟、绿熟、中等成熟、完熟果实，R-Unripe、R-Early ripe、R-PaRially ripe、R-Fully ripe为热农1号杧未成熟、绿熟、中等成熟、完熟果实；数字代表重复。

2.7 qPCR定量分析

为了验证MiPEPCs的表达情况，重新采集杧果样品，开展qPCR实验。结果显示，贵妃杧各组织中，MiPEPC1的表达量相对较高，MiPEPC2，MiPEPC3和MiPEPC4表达量相对较低，在有些组织中甚至几乎不表达，如贵妃杧的花、果皮、果肉和种子。总体而言，MiPEPCs在贵妃杧中的表达与阿方索杧转录组中表达情况相似，都显示出了一定的偏好性，但存在差异，这可能由于品种间存在生理生化上的差异。

在高糖品种红杧6号和低糖品种香杧果肉组织的qPCR试验中发现，MiPEPC2和MiPEPC4表达较低且无明显差异。MiPEPC1和MiPEPC2表达量较高，且与高糖品种台农一号杧与低糖品种热农1号杧转录组中的相对表达情况几乎一致。即MiPEPC1和MiPEPC2在两个品种中均是完熟时期表达量更高，且同一时期在高糖品种红杧6号果肉中的相对表达量明显高于低糖品种香杧，验证了此前的推测(见图8)。

图8 杧果MiPEPC荧光定量分析

3 结论与讨论

本研究从杧果基因组共鉴定得到4个MiPEPC家族成员，该家族蛋白长度、等电点、相对分子质量等理化性质较为稳定，且均定位于细胞质。这与大豆[10]、油菜[19]、水稻[9]上的研究结果相似。联合拟南芥、水稻、菠萝和杧果PEPC基因进行系统进化、保守结构域和保守基序分析，发现可分为2个亚族，其中3个MiPEPCs聚集在第I亚族(PTPC)，MiPEPC4在第II亚族(BTPC)，且不同物种均仅有1个BTPC。

所有PEPCs蛋白均含有PEPcas结构域，同一亚组的保守结构域趋向于相似位置，保守基序的种类和位置也较为相似，并且不同PEPCs蛋白间至少存在8个共同的保守基序；表明PEPCs家族成员蛋白在不同物种间存在一定的保守性，但植物型和细菌型的杧果MiPEPCs基因结构上差异较大[20]。细菌型的2个PEPcas，分别与PTPCase的5′端和3′端有一定的相似性，但其蛋白间差异则较大，且在不同物种中(包括单子叶和双子叶植物)均能得到相似的结果，这或许说明，PTPC和BTPC最初来源于同一祖先基因，但两者进化上分化的时间应相当久远(早于双子叶植物和单子叶植物分离时间)，且分化后PTPCs和BTPCs在不同物种中稳定遗传[21]。

基因的表达往往受到启动子区域的顺式作用元件调控[22]，有研究表明，存在多重应激反应的基因常与启动子区域的顺式作用元件密切相关[23]。从启动子区域顺势作用元件分析来看，MiPEPCs基因启动子区含有大量的光信号诱导和激素响应相关的元件，说明该家族可能在杧果的光响应和激素响应等过程发挥重要作用；同时也说明MiPEPCs基因的表达存在多重因素的调控。其中MiPEPC2启动子上含有激素元件最多，特别是脱落酸ABA和茉莉酸(MeJA)元件，分别有6个和8个，说明该基因可能较易受到脱落酸ABA和茉莉酸(MeJA)的诱导，参与杧果逆境响应和信号转导等过程[24]。

在不同组织中的表达情况显示，MiPEPCs在不同组织中均有表达，但表达差异较大，具有偏好性。在叶片中表达量较高的是MiPEPC1和MiPEPC4，结合MiPEPC1为PTPC，推测其可能在杧果光合作用中起到重要作用；而MiPEPC4则可能配合MiPEPC1发挥作用。除此之外，MiPEPC1在杧果根、花和果皮组织中高表达，MiPEPC3在花、果皮、果肉中高表达，MiPEPC4在树皮、根、花、果皮和果肉中高表达；表明杧果PEPC家族可能参与多个非光合作用生物学过程[25]，MiPEPC4(细菌型)的功能尤其值得深入了解。

在其他植物上的研究表明，PTPCs参与果实成熟过程。番茄上的研究表明，在果实成熟过程中，PTPC可能通过调节细胞中苹果酸和柠檬酸的积累来影响呼吸作用[8，26]，并为糖积累提供碳源[27]；香蕉成熟过程中PTPC的磷酸化可能与起到维持细胞碳骨架的作用有关[28]。此外，还有研究表明，番茄果实PTPC主要位于果皮快速扩张的细胞中，其产生苹果酸用于维持渗透电位，使细胞快速扩张[5]。关于BTPCs功能的研究则较少，有研究认为，BTPC编码的蛋白可能与植物型 PEPC蛋白共同构成八聚体复合体，被多个磷酸化位点调控[25]。在高糖品种台农一号杧和低糖品种热农1号杧不同发育阶段的果肉中，PTPC基因MiPEPC1、MiPEPC3有相似的表达模式，即在果实发育前期表达量低，而在果实发育后期高表达；且同一发育时期在高糖品种台农一号杧中表达量显著高于低糖品种热农1号杧，表明MiPEPC1、MiPEPC3可能与杧果果实成熟过程中生理生化反应密切相关。在高糖品种红杧6号和低糖品种香杧果肉qPCR试验，很好地验证了这一推测。BTPC基因MiPEPC4在两个品种果肉发育过程中没有明显的相似性，但表达差异较大，其可能也参与到杧果果实成熟的某些生物学过程。总之，杧果PEPCs在果实发育中的作用值得进一步探讨。

本研究从杧果全基因组鉴定得到分属植物型和细菌型的4个MiPEPCs，全面分析了其理化性质、保守结构域、保守基序、系统进化、基因结构、顺势作用元件及在杧果不同组织的表达情况，初步推断MiPEPC1、MiPEPC3可能参与杧果果实成熟过程，为进一步研究杧果MiPEPC的功能奠定了基础。