木芙蓉花期不同阶段主要器官内源激素含量的变化*

朱章顺，王强锋，李芹，马娇，夏中梅，侯勇，王海涛，胡凤科，徐远超

(1.成都市植物园,四川 成都 610083;2.四川省农业科学院 生物技术核技术研究所,四川 成都 610066;3.四川省兰月科技有限公司,四川 成都 610207)

木芙蓉(HibiscusmutabilisLinn)为锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)落叶灌木或小乔木植物，为我国长久栽培的城市绿化及观赏植物，广泛分布于四川、云南、湖南、广西、广东等地。四川成都有着最悠久的木芙蓉花栽培历史，“蓉城”由此而来。芙蓉花是成都的象征，1983年5月26日成都市人大把芙蓉花定为市花，银杏为市树，每年农历九月初九为市花市树节[1]。木芙蓉花期较长，花期不一致导致不同花朵先后开放不整齐，对木芙蓉观赏性和整体美化效果造成不利影响。内源激素是一类重要的植物生长调节物质，与花的生长发育密切相关，多种内源激素的相互作用共同调控植物的花期。

植物内源激素是微量的、自然产生的物质，目前，已分离鉴定了生长素(IAA)、赤霉素(GA)、细胞分裂素(CTK)、乙烯(ETH)、脱落酸(ABA)、油菜素内酯(BR)、水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等不同的植物激素[2-3]。内源激素通过复杂的信号转导途径参与调节植物各个生理过程，植物激素信号之间存在相互作用，具有复杂的网络关系，其含量的多少及比例对植物正常生命活动有重要影响[3-6]。蜜柑(CitrusunshiuMarc.)叶片中较高浓度的GA3抑制花芽分化，高IAA和ABA含量促进了花芽形成[7]。忍冬(LonicerajaponicaThunb.)花高水平IAA、低水平ABA、高IAA/ABA、ZR(玉米素核苷)/ABA、IAA/GA3及低ABA/GA3、ZR/IAA是影响忍冬‘特蕾1号’大白期时长的主要因素[8]。在白魔芋(Amorphophallusblume)花芽形态分化时期，较高浓度的IAA、GA3和ZT(玉米素)在雌蕊成熟过程中起促进作用，在同一过程中，高浓度的ABA/IAA，ABA/ZT和ABA/GA3均不利于雄蕊的成熟，高浓度ABA是抑制雄蕊成熟的关键因子[9]。在苹果(Malussieversii)中，ZR、ZR/GA3分别与短枝比例呈正相关，GA3与花序数量呈负相关，苹果幼树开花相关指标分别与细根中的IAA、ZR、GA3、IAA/ZR呈正相关，内源激素在地上部成花与地下部根系生长过程中具有重要调节作用[10]。目前，国内外未见木芙蓉内源激素相关报道。由于内源激素在植物体内含量极低，结构复杂，存在很多相互共存的干扰成分，并且容易受光照、温度和酸碱度的影响导致变性[11]。因此，对内源激素的高效提取、内源激素检测的精度和准确度要求较高。目前，高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)和质谱法(MS)以其分离效率高、检出限低、耗时少、样品量少等优点，已成为植物激素的重要分析方法[11-12]。

内源激素是影响植物开花的重要因子，木芙蓉的花具有二次盛开的特性，即木芙蓉顶端的花蕾经过一段时间的发育后再次集中开放，内源激素对其开花过程可能具有独特的调节作用。现阶段，木芙蓉开花特性受内源激素调控机理的研究还不完善，花期调控技术有待提升。本文研究了木芙蓉花期不同阶段，即花芽分化期、花芽分化后期、花蕾期、初花期、盛花期、盛花末期、二次盛花期和末花期的叶、花中内源激素水平、动态变化规律、比例关系等，可为后期通过非自然的方式调控木芙蓉花期，提高木芙蓉观赏性提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 研究区概况

研究区位于成都市植物园苗圃基地，该地区属中亚热带湿润季风气候区，无霜期较长，四季分明，冬春少雨，夏秋多雨，雨量充沛，年平均降水量为900～1 300 mm，年平均气温在16 ℃左右，木芙蓉栽植土壤为黄壤。

1.2 试验材料与试验设计

以木芙蓉品种‘锦绣紫’为试验材料，根据不同花期采集木芙蓉叶片、花蕾、盛开花和衰败花样品保存为鲜样，测定IAA、ABA、GA3、CTK和ETH的含量。分别于木芙蓉花芽分化期(2019-05-13)、花芽分化后期(2019-05-30)、花蕾期(2019-06-11)、初花期(2019-07-05)、盛花期(2019-07-26)、盛花末期(2019-09-09)、二次盛花期(2019-09-30)、末花期(2019-11-13)随机采集9株木芙蓉叶片、花蕾、盛开花和衰败花，各器官样品采集后立即放入液氮冷冻，放入冰盒，带回实验室进行内源激素提取与收集，多余样品置于-80 ℃冰箱中留存备用。

采样时期作如下定义：花芽分化期指木芙蓉植株枝梢顶端有5～6片真叶，能见明显叶芽，花芽肉眼不可辩认的时期；花芽分化后期指木芙蓉植株枝梢顶端花芽肉眼可辨认的时期；花蕾期指木芙蓉花蕾最大横径约1 cm、花柄长度约3 cm以上的时期；初花期指木芙蓉整株有三分之一左右花蕾开放的时期；盛花期指木芙蓉整株有二分之一左右的花蕾开放的时期；盛花末期指木芙蓉植株整株有三分之二以上的花蕾已开放的时期；二次盛花期指木芙蓉植株顶端花蕾经过发育后开放二分之一的时期；末花期指花蕾全部开放的时期。

其中：采集的花蕾是指花蕾横径1～2 cm、花柄长度3 cm以上，花蕾未破的形态；盛开花指开放当天，花瓣呈向外展开形态的花朵；衰败花指花朵开放24～48 h，花瓣呈萎蔫状态的花朵。由于木芙蓉花盛开后次日就萎蔫衰败，因此在初花期也有衰败花样品；在末花期花蕾已全部开放，无花蕾的样品。

1.3 试验方法与处理

1.3.1 高效液相色谱法测定IAA、GA3、ABA、CTK含量

以甲醇+磷酸缓冲液或水为流动相，使用C18的不锈钢反向柱和紫外检测器，对样品中的IAA、GA3、ABA、CTK进行高效液相色谱分离和测定，外标法定量。

(1)标准样品溶液制备及定量工作曲线建立

少量甲醇溶解IAA、GA3、ABA、CTK，用酸性流动相配制浓度为3 mg/L的IAA、GA3和ABA溶液，用中性流动相配制3 mg/L的CTK溶液。上述溶液进一步稀释成系列标准溶液用于检测，最终标准曲线相关系数R2>0.99方可使用。

(2)样品溶液的制备

参考文献方法[13-15]并作适当改进。取适量的叶片或花，快速机械破碎，准确称取样品约20 g于已加入0.5 g三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠(抗氧剂)烧杯中，再加50 mL预冷甲醇(上述过程10 s内完成)，搅拌均匀，超声破碎2 min，盖上表面皿在4 ℃下冰箱中避光浸提过夜；倾倒上清液，再加50 mL预冷80%甲醇继续浸提2 h；连续收集3次浸提液，先过滤浸提液再过滤残渣，少量80%甲醇多次清洗，过滤于烧瓶中(约200 mL)；40 ℃条件下减压浓缩至20 mL左右(尽量去除甲醇)；将浓缩样品无损转移到分液漏斗中，加入与样品体积1︰1的石油醚和0.05 g的聚乙烯吡咯烷酮萃取；重复一次，水相加入与水相体积1︰1的石油醚萃取；水相经C18小柱(型号：LC-C18 SPE Cartridge，500 mg，3 mL)固液分离，收集滤液。用1 mol/L柠檬酸将滤液pH调至2～3，用20 mL乙酸乙酯萃取两次，分别收集两次萃取后的乙酸乙酯(40 mL) 和最后一次的水相(20 mL)；水相用pH=9氨-氯化铵调至pH=6左右，定容至25 mL，过0.45 μm滤膜用于测定CTK；乙酸乙酯相再用20 mL且 pH=10氨-氯化铵缓冲液萃取2次，收集2次水相40 mL，水相重复上面操作调酸，乙酸乙酯萃取两次，收集乙酸乙酯相，用氮吹仪吹干，甲醇溶解，棕色容量瓶定容至5 mL，过0.45 μm有机滤膜用于测定IAA、ABA和GA3。

(3)高效液相色谱操作条件

IAA含量测定条件：流动相为甲醇︰磷酸水溶液(35︰65)，波长280 nm；GA3含量测定条件：流动相为甲醇︰磷酸水溶液(35︰65)，波长210 nm；ABA含量测定条件：流动相为甲醇︰磷酸水溶液(50︰50)，波长254 nm；CTK含量测定条件：流动相为甲醇︰水(30︰70)，检测波长280 nm。

(4)回收率测定

在设定的色谱条件下，配制3种不同浓度的植物激素标准液，通过液相保留时间和峰面积，分析植物激素的重现性和再现性。

采样添加标样法测定回收率[12]，在最佳纯化及色谱分析条件下，向测试样品中加入4种植物内源激素各1 mg，测定加标后样品激素含量，5次重复，计算加标回收率和相对标准偏差。

(5)IAA、GA3、ABA、CTK含量计算

式中：A1为标样溶液中，目标物峰面积的平均值；A2为试样溶液中，目标物峰面积的平均值；m1为标样的质量(g)；m2为试样的质量(g)；P为标样中目标物的质量分数(%)；D为稀释倍数关系。

1.3.2 气谱法测定ETH含量

(1)样品处理及乙烯收集

称取适量样品(15 ～20 g)，放入玻璃瓶中，塞好橡皮塞，用封口膜将缝隙密封，在25 ℃室内，存放20 h。轻摇玻璃容器，将注射器内空气彻底排除，用排水法收集玻璃容器内体积30 mL，转移至铝箔采样袋中。

(2)气相色谱条件

北分瑞利，3420A气相色谱仪；氢离子火焰检测器(FID)，检测器150 ℃；30 m毛细管柱，柱温60 ℃；进样口60 ℃；燃气氢气流速40 mL/min，空气流速400 mL/min，载气氮气流速50 mL/min。顶空进样针进5 μL样品，重复测定3次。

(3)乙烯标准曲线绘制

配制浓度为0.002、0.004、0.008、0.012、0.016 mL/L的5个标准气体样品，绘制乙烯标准曲线。

(4)乙烯含量计算

乙烯浓度(mL/L)=(样品平均峰高/标准乙烯平均峰高)×标准浓度

乙烯含量以单位时间内单位质量的木芙蓉样品乙烯释放量计，单位为：mL/(h·g)。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2013进行数据统计，Origin 9.0进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 木芙蓉内源激素测定方法可行性

2.1.1 IAA、GA3、ABA、CTK测定谱图及回收率

根据上述条件，IAA、GA3、ABA、CTK提取效果较好，样品色谱图和标样色谱图一致，木芙蓉样品谱图见图1。

图1 木芙蓉内源激素IAA(A)、GA3(B)、ABA(C)、CTK(D)高效液相色谱图

4种激素的平均回收率为82.72%～105.58%(表1)。说明精确性良好，本方法的可靠性较高。

表1 内源激素IAA、GA3、ABA、CTK的峰保留时间和平均回收率

2.1.2 木芙蓉内源激素乙烯测定

上述方法操作简便、灵敏度高，乙烯标准曲线y=384.3x-76.43，R2=0.999；本操作条件能快速准确地测定木芙蓉内源乙烯释放量，其峰保留时间0.84 min。

2.2 花期不同阶段木芙蓉叶、花中内源激素含量

花期不同阶段木芙蓉叶、花中内源激素含量测定结果见图2。

图2 花期不同阶段木芙蓉叶、花中内源激素含量变化

叶、花中IAA含量在花期不同阶段差异较大(图2A)。由花芽分化期到初花期，叶中IAA含量呈逐渐升高的趋势；由初花期到末花期，叶片中IAA含量呈“W”型变化趋势，在盛花期和二次盛花期相对较低；花蕾中则表现为相反的趋势，在盛花期和二次盛花期含量相对较高；盛开花和衰败花中IAA含量在初花期含量最高，其后大幅减少，盛开花中IAA含量降低76%～91%，衰败花中降低85%～93%。可见，初花期叶、花中IAA较丰富，主要分布在已开放的花朵中，后期主要分布在叶片和花蕾中。

叶、花中ABA含量整体表现为逐渐增加的趋势，叶、花中增幅不同(图2B)。叶片和衰败花中ABA含量在末花期达到峰值，ABA含量分别是初花期的7.34、13.79倍；花蕾和盛开花中ABA含量先增加后降低，在盛花末期时含量较高。可见，在木芙蓉花朵由开放到衰败的过程中，ABA在叶、花中逐渐累积，在盛花期和盛花末期主要累积在盛开花中，第二次盛花至末花期主要累积在衰败花中。

叶、花中GA3含量的变化呈现明显的差异(图2C)。从花芽分化期到初花期，叶中GA3含量降低，花芽分化期最高；从初花期到末花期，叶中GA3含量呈“～”型变化趋势，在盛花末期和末花期含量相对较高；花蕾中GA3含量在盛花期和二次盛花期相对较高；盛开花和衰败花中GA3含量初花期极低，其后大量增加，与叶中GA3相似，在盛花末期和末花期含量相对较高。

叶、花中CTK含量的变化特征不同(图2D)。叶中CTK含量花芽分化期最高，随后大幅降低；花蕾中CTK含量盛花期最高，盛花末期几乎未检测到CTK，二次盛花期CTK含量升高；盛开花中CTK含量随花朵衰败有明显的降低，盛花末期和末花期CTK含量远低于盛花期，其中二次盛花期含量最高；衰败花中CTK含量整体表现为逐渐降低的趋势，在初花期最高。可见，在开花早期阶段(初花期和盛花期)，叶、花中CTK含量丰富，随花朵衰败CTK含量明显降低。

叶、花中ETH含量变化趋势较一致，ETH含量缓慢升高，从初花期到末花期变幅较小(图2E)。

2.3 花期不同阶段木芙蓉叶、花中内源激素间比例关系

不同阶段木芙蓉叶、花中内源激素间比例关系见图3。

图3 花期不同阶段木芙蓉叶、花中内源激素间比例关系

由图3可知，初花期以后，叶片中GA3/CTK比值呈快速上升趋势，盛开花中GA3/CTK比值逐渐升高，在盛花末期到达峰值，随后呈下降趋势；盛花期，盛开花和衰败花中ABA/IAA比值较高；与其他时期相比，盛花末期花蕾中GA3/CTK、ABA/GA3和ABA/IAA值较高。

3 讨论与结论

内源激素是调节花芽分化的关键，植物的不同内源激素平衡状态影响花芽分化。本试验发现，木芙蓉花芽分化期叶片中的GA3、CTK、ABA含量较高。其他植物，如香舌兰(VanillaplanifoliaAmes)在花芽分化过程中，生长素(IAA)具有促进花芽分化的作用，玉米素核苷(ZR)和赤霉素(GA)具有抑制花芽分化的作用，脱落酸(ABA)具有先促后抑的作用，低水平的GA/ZR对花芽形成具有促进作用[16]。因此，木芙蓉花芽分化期叶片中较高含量的GA3、CTK，叶片中较低水平的GA3/CTK，有利于促进木芙蓉花芽分化；相对较高水平的ABA抑制了茎尖的营养生长，从而与IAA、GA3和CTK相互作用，使茎尖由营养生长转入生殖生长，促进花芽分化。

木芙蓉‘锦绣紫’品种相对于其他品种而言，衰败花在盛花期不易掉落，而在末花期衰败花较易掉落。从内源激素来看，在木芙蓉‘锦绣紫’的盛花期，叶片和衰败花中ABA含量处于相对较低水平，在二次盛花期和末花期，叶片和衰败花中ABA含量均处于高水平。已有研究表明，植物的衰老过程受多种内源激素的共同参与，通过外源茉莉酸甲酯诱导银杏(GinkgobilobaL.)叶片衰老过程中，内源性ABA水平显著增加，而CTK、GA和IAA的含量和未经处理的自然衰老叶片相比变化不大，各种激素信号，特别是ABA在调控叶的衰老过程中发生作用[17-18]。因此，在木芙蓉‘锦绣紫’的整个开花周期中，二次盛花期和末花期阶段，植株叶片才进入衰老过程，此时衰败花中较高的ABA含量会加快其掉落。

在木芙蓉整个开花时期，盛开花中ETH含量高于衰败花。已有研究表明，在许多植物物种中，花的衰老是由气体激素乙烯(ETH)促进和细胞分裂素(CTK)类激素抑制[19]，ABA含量升高不影响开花时间和开花表型[20]。因此，盛开花中ETH快速产生，可能是盛开花维持时间较短的主要原因。但本研究中乙烯含量为各器官在离体条件下收集测定，不一定反映活体状态下真实的乙烯释放水平，其乙烯的变化特征还需进一步探讨。

部分木芙蓉品种有二次盛花的现象[21]，结合本研究发现，两次开花过程的内源激素水平差异较大，主要表现在ABA含量上。叶片中GA3含量从盛花期到盛花末期表现为升高，二次盛花期时GA3含量降低，在末花期时其含量升高，IAA与GA3趋势基本一致，但ABA含量从盛花期快速升高持续到末花期。花蕾在初花期以后，其ABA含量逐渐升高，到盛花末期达到峰值后降低，两次盛花期的花蕾中ABA水平差异不大。而盛开花中，其ABA含量在盛花期和盛花末期高于二次盛花期和末花期。从开花到衰败的过程中，叶中IAA、GA3、ABA、ETH含量升高，仅CTK降低；花蕾中IAA、GA3、CTK含量降低，ABA和ETH升高；盛开花和衰败花中IAA和CTK含量降低，GA3、ABA、ETH升高。因本研究是对木芙蓉花期内源激素的首次探究，对木芙蓉花期的界定亦无可参考依据，实际采样过程中按照其开花表现分成盛花期和二次盛花期，从内源激素水平分析，叶片在盛花末期以后才进入衰老过程，二次盛花期过程中内源激素的影响较为复杂。

综上所述，在花芽分化期，木芙蓉叶片中较高含量的GA3、CTK、ABA可促进花芽分化。在木芙蓉二次盛花期，叶、花中内源激素水平随花期波动变化，ABA含量变幅最大，ETH含量较为稳定。GA3、ABA、ETH含量增加可促进木芙蓉开花，加速花朵的衰败。今后，可在花芽分化前期外源补充GA3、CTK和ABA等激素，研究其是否提前花芽分化，在花蕾期补充IAA和GA3，研究其是否提前开花，在盛花期补充ABA，观察其残花是否容易掉落；同时结合转录组等技术研究植物激素对花期的调控机理，以期为木芙蓉花期调控技术提供更充分、更深入的理论依据。