DNA倍体分析在乳腺癌中研究进展

李洪波，郑雪松，王文慧

女性乳腺癌(Breast Cancer)已成为全球女性发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤，对女性生命健康造成极大影响[1]。乳腺癌在我国女性癌症疾病中位居首位，已成为发病率和死亡率增长迅速的恶性肿瘤[2]。DNA倍体分析现有数十年研究发展史，近十年来随着科学知识更新，相关学者正在多个领域探索倍体与疾病的关系。本文将对乳腺癌与倍体分析研究现状进行复习并综述。

1 乳腺癌与DNA检测指标关系

正常人体细胞有46条染色体，其DNA含量稳定且多恒定不变的称二倍体细胞。DNA含量是细胞分裂增殖基础，其含量及倍体与细胞增殖活跃呈正相关，常人为二倍体，若机体发生癌变，DNA含量会发生变化，可能会出现非整倍体[3]。当有致癌因素刺激机体时，DNA会遭到损害,基因突变，染色体畸形或断裂,在细胞增殖过程倍体含量发生质或量的变化,生物学特性发生改变,可能发生发展为肿瘤细胞[3-4]。非整倍体出现可作为恶性肿瘤侵袭标志，多与肿瘤的恶性程度有关，当检测到非整倍体时，机体内可能在发生肿瘤相关变化，但当病理结果正常，而有非整倍体发生时，这可能预示着恶化的肿瘤细胞在发生发展变化[5]。在肿瘤病理学中，S期细胞比率(SPF)是可以反应DNA合成能力的增殖细胞百分比的指标，通过检测SPF来反应肿瘤细胞复制以及增值能力[6]。应用DNA指数值(DNA index DI)来判断倍体和相对含量及对倍体进行分类[7]。这将有利于倍体的检测及评估。

2 DNA倍体的检测手段

目前倍体检测手段主要有三种，细胞图像分析(ICM)、流式细胞术(FCM)和激光扫描细胞仪(LSC)。DNA图像分析(DNA-ICM)是对DNA含量测定来判断乳腺癌肿瘤细胞发生发展程度和遗传基因变异过程，DNA-ICM具有数据客观、操作简单、重复试验、性价比高等优点[8]。流式细胞术(FCM)现已广泛应用临床与科研中，通过对DI和SPF测定，来判断乳腺癌肿瘤细胞中染色体状态及其增殖活性，非整倍体的出现作为恶性肿瘤重要标志之一，而SPF可以作为一个显著的预后因素[9-10]。目前FCW已广泛用于全身肿瘤检测，主要意义是早期癌变和癌前病变的诊断、对于细胞周期应用的化疗方案的选择及对肿瘤预后评估。特别是对肿瘤细胞倍体及SPF的检测有着重要意义。非整倍体出现可能早于形态学变化，即对早期不典型肿瘤有着提示警醒作用，同样多数非整倍体出现提示患者预后不是很好，复发风险较大，死亡风险较高，相反二倍体或近二倍体则状况较好[11]。FCW用于细胞周期检测和DNA倍体分析已成为一种成熟的技术，并在肿瘤学的科研和临床中广泛应用，为肿瘤的诊断、指导治疗和预后可能性提供了重要的参考指标[12]。激光扫描细胞仪(LSC)是发展较为迅速的一种仪器，由于其对DNA倍体测量的检测度更好，特别是对肿瘤基因改变的判定有较大优势，LSC显示出较大的潜力成为未来细胞分析实验室的主要工具[13]。

3 倍体分析在乳腺癌的临床应用

乳腺癌作为一类具有多种不同亚型、不同的生物学的异质性疾病，其淋巴结状态、瘤体大小及分化程度是评估预后经典因素，同时加以激素受体状态和HER2表达(FISH检测)来补充评估，上述因素可以合并为预后指标，更好地估计患者复发或死亡的风险[14]，其他评估预后因素研究一直是学者们研究方向，但是没有确定的临床进展。而现在分子医学的进步已大大提高了乳腺癌基因表达谱分析的准确性，从而提高了预测患者乳腺癌复发风险以及对内分泌治疗和/或化疗可能产生反应的能力，这些基因组测定法已协助医生为个体患者量身定制治疗方案[15]。在过去的数十年，国内外很多学者均研究倍体分析在乳腺癌中的应用，同时在诊断、治疗及预后方面取得一些进展。

3.1 DNA倍体分析在乳腺癌中诊断应用 国外学者Gazic等[16]研究细针穿刺(FNA)活检取得组织用于FCW分析，结果为：DNA倍性和SPF与肿瘤类型、大小、淋巴结状态，尤其是肿瘤等级相关。Xu[17]团队汇总了29个研究数据，共涉及141,163例病例的META分析表明乳腺癌晚期肿瘤、肿瘤>2 cm、淋巴结转移、较差的肿瘤扩散在非整倍体中比例较高，且有统计学意义。一直以来，倍体分析的应用都是通过获取活体组织细胞进行检测，这可能会导致早期诊断和最佳治疗的延迟及不必要的治疗的毒副作用。即使有学者在做局部穿刺相关研究，但是已明确的是在病理形态发生改变之前的倍体已改变，现寻求可以无创检测DNA倍体数的方法，即在体内检测DNA含量进一步提前进行疾病诊断，这对于癌症手术前制定术前辅助治疗和其他诊治计划是所必需的。Kim 等学者[18]研究乳腺癌18F-氟代脱氧葡萄糖(FDG)摄取与DNA倍体关联性，通过对44例乳腺癌患者研究双时间点正电子发射断层显像(PET)摄取18F-FDG与DNA倍体和SPF的关系发现：非整倍体18F-FDG摄取和RI高于二倍体人群；此外，高SPF的RI高于低SPF人群；他们认为18F-FDGPET/CT可能是预测DNA倍体含量的一种无创性和有用的工具。这与临床工作的科研思路不谋而合，是否可以通过无创操作对疾病进行进一步检查、确诊，不用进行组织活检测定倍体含量，这对医患双方均利大于弊。

3.2 DNA倍体分析在乳腺癌中治疗作用 当前新辅助治疗逐渐成为乳腺癌重要选择治疗方法，其好处有增加乳房保护、评估肿瘤反应、基于病理反应确定预后及为无反应的患者提供“二次机会”干预等；新辅助化疗(NACT)下实现病理完全缓解(pCR)与长期临床获益相关，确定疗效预测结果是研究热点[19]。国内学者张景臣等[20]对66例NACT患者研究发现：NACT前，SPF较大者对化疗更敏感，这能更好评估肿瘤对化疗药物的反应及敏感性，SPF作为增殖指标是有意义的，NACT可降低癌细胞增殖活性，根据细胞周期发生原理合理选择化疗药物，这对治疗重要性不言而喻。NACT疗效反应多是通过影像学评估[21]，辅以倍体检测，取得组织可以行倍体分析和免疫组化分析,Ki-67作为细胞增殖和分裂标志物，可用于肿瘤细胞增殖评估[22],这二者是相辅相成的。同时根据大数据分析的Xu[17]也认为：与非整倍体癌患者相比，患有二倍体肿瘤的乳腺癌患者的临床疗效更好。

3.3 DNA倍体分析在乳腺癌中预后作用 国外学者Gazic等[16]发现非整倍性和高SPF与较短的总生存期(OS)、无病生存期(DFS)相关，SPF显示出独立的预后意义。Pinto等[23]研究了393例乳腺浸润性导管癌(IDC)患者，中位随访134个月，评估DNA倍体、SPF与DFS的关系后发现，死亡和复发总人数中大多数患者肿瘤为非整倍体，非整倍性与肿瘤更高分化程度、生存期较短有显著相关性，是预后较差的指标。而较高的SPF有着更高的分化程度、与疾病晚期相关。因此他们认为DNA倍性是IDC长期存活的独立预测因子。这同样与Yildirim-Assaf等[24]研究结果一致。在目前临床治疗中，明确的是系统辅助治疗可以明显延长淋巴结阳性乳腺癌患者生存时间，针对淋巴结阴性乳腺癌患者的辅助治疗暂无系统规范，且淋巴结阴性乳腺癌的预后因素尚无定论[25]。因此，对于乳腺癌患者来说，甄别出辅助治疗的低风险群体和需要辅助治疗的高危群体是重要的，所以Yildirim-Assaf等[24]在做出相关研究后得到结论：DNA倍体含量作为肿瘤侵袭性的客观指标，可为淋巴结阴性和淋巴结阳性的乳腺癌患者提供预后信息，即根据情况为低、高风险组，进而指导患者从其他辅助治疗中受益。这同样与Xu[17]、Pinto[23]、Eramah[26]得出结果是相仿的，均认为DNA倍体与腋窝淋巴状态有着重要关系,同时更是乳腺癌的预后主要因素，为早期干预提供有价值线索。而组织学分级是作为乳腺癌主要的预后因素，但在中级分化的人群中，患者可能会出现无法预测的结果，因此Pinto等[27]针对684位浸润性乳腺癌的患者随访研究后认为非整倍体可以识别G1.G2肿瘤的人群，这对于不同风险人群的辅助治疗起到积极的指导意义。

4 非整倍体的未来价值

近年来有学者着重强调分子时代非整倍体的价值，染色体不稳定性(CIN)作为癌症的一个中心过程正日益受到关注。CIN，无论过去还是现在，只要肿瘤细胞含有异常数量的DNA，称为“非整倍体”。癌症组织中的非整倍体被认为是预后不良的预测因子[28]。当下对于非整倍体研究多集中在两点。

中心体异常：中心体异常是导致非整倍体出现继而引发肿瘤的普遍特征，其通过多种机制促进肿瘤发生[29]。中心体异常缺陷导致中心体过多复制，或导致倍体的增加。所以进行中心体研究可以控制肿瘤发生发展。Cappello等[30]研究发现：高度侵袭性三阴性乳腺癌暂无有效治疗手段，但NK2作为中心体调节剂，可以导致癌细胞衰老，诱导非整倍体、细胞周期停滞，促进肿瘤抑制因子的活性，增强化疗干预措施。Denu等[31]发现中心体扩增与肿瘤高倍体有关，与乳腺癌预后有关系，对中心体扩增及下调进行药物干预时，可以改善癌症患者结局。Bilinski 等[32]研究性激素诱导小鼠乳腺癌内分泌治疗中发现：非整倍体肿瘤中含有多个中心体，同时这种现象与管腔型乳腺癌内分泌治疗耐药性有关。这为下一步内分泌耐药性研究提出新的方向。

染色体不稳定性：乳腺癌免疫组化(IHC)Her-2结果为(2+)的情况下，需要做FISH检测是必要选择，这样可以针对患者进行更优化的治疗。Halilovic等[33]通过FISH分析，发现17号染色体(CEP17)的扩增与非整倍体有关，非整倍体与不良的临床结果有关，这提示我们在改善未来的治疗策略时有更好的检测手段。Securin参与细胞周期中染色体完整性的调控及DNA损害修复凋亡，Karra等[34]发现高水平的Securin表达预示着DNA非整倍体的几率的增加，securin显示出疾病特异性检测独立预后价值，这利于乳腺癌预后的评估。Oltmann等[35]认为在二倍体和非整倍体肿瘤患者中，FISH分析显示明显非整倍体肿瘤中基因组不稳定性和肿瘤异质性增加，所有非整倍体病理中MYC均扩增和TP53突变增强，通过检测染色体不稳定性和基因突变情况去制定合理方案。非整倍体的出现对于研究人员来说，无疑是个巨大的挑战，可以预料的是，这对于癌症难关的攻克，同样是个难得的机会。

近几十年来DNA倍体分析应用从成熟到落寞，它可以利用细胞周期来提前检测肿瘤变化，根据不同周期阶段表现，判断肿瘤发生发展，结合临床指标、病理学参数可对乳腺癌生物学行为做出更准确评估。近年来NACT治疗的兴起及非整倍体研究再次将倍体分析推上研究热潮。在未来的分子生物学发展的时代中，DNA倍体分析有待于学者们更多的发掘与应用。