SRAP标记在秋石斛杂交后代鉴定中的应用

林榕燕 陈艺荃 钟淮钦 林兵 叶秀仙

摘要：基于序列相关扩增多态性（SRAP）分子标记对秋石斛四面佛与水芙蓉的杂交后代进行鉴定，并进行遗传多样性和聚类分析。结果显示，共筛选出5对SRAP引物组合用于杂交后代真实性的鉴定，供试17个杂交后代新株系均鉴定为真杂种;5对SRAP引物组合共扩增到23个多态性条带，多态性比例为88.46%。从聚类结果可以看出，绝大多数杂交后代在亲缘关系上先倾向于母本后倾向于父本;遗传相似系数分析结果表明，杂交后代与母本间的遗传相似系数大于父本，说明供试杂交后代在遗传上更偏向于母本，与聚类结果吻合。由研究结果可以看出，所筛选的5对SRAP引物组合用于秋石斛杂交后代鉴定是可行的。

关键词：秋石斛;SRAP标记;杂交后代鉴定;聚类分析;遗传相似性分析

中图分类号： S682.310.3  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）22-0055-04

收稿日期：2021-04-16

基金项目：福建省省属公益类科研院所专项（编号：2019R1031-6）;福建省农业科学院自由探索项目（编号：ZYTS2019003）;福建省农業科学院科技创新团队建设项目（编号：CXTD2021010-2）。

作者简介：林榕燕（1990—），女，福建平潭人，硕士，助理研究员，主要从事花卉生物技术研究。E-mail：lryyan@163.com。

通信作者：叶秀仙，副研究员，主要从事花卉育种与组织培养技术研究。E-mail：yxx7861@163.com。

秋石斛（Dendrobium spp.），别称蝴蝶石斛，为兰科石斛属植物，其花朵鲜艳、花期长，是一种重要的切花和盆花种类[1]。秋石斛喜温暖、湿润的生长环境，对温度的要求高，低温被普遍认为是秋石斛在我国推广应用的瓶颈[2]。因此，培育出性状优异、抗寒性强、具有自主知识产权的秋石斛新品种已成为秋石斛育种的重要方向。目前，杂交育种仍然是获得秋石斛新品种最为常用的方法，笔者所在课题组前期采用表型性状、序列相关扩增多态性（SRAP）分子标记、种质适应性及抗寒性生理分析等评价方法，建立了石斛兰综合评价体系，筛选出多个综合性状优异的亲本，并对其开展杂交结实性研究，其中以四面佛为母本、水芙蓉为父本的这一杂交组合的结实率达100%，杂交种子经无菌播种繁殖后获得了一批后代群体。但是由于石斛兰新品种的选育周期较长，为加快育种进程，对其杂交后代真实性的早期鉴定显得尤为必要。

随着分子生物学技术的发展，分子标记技术因其众多优点而成为目前国内外植物杂交鉴定的高效技术手段之一。SRAP标记是一种基于PCR的新型分子标记[3]，具有重复性好、共显性高、操作简便等优点，目前已被广泛应用于菊花[4]、百合[5]、大豆[6]、枇杷[7]等多种植物杂交后代的鉴定研究中，但目前尚未有基于SRAP分子标记的秋石斛杂交后代鉴定的相关报道。因此，本研究基于SRAP分子标记手段，对秋石斛四面佛与水芙蓉杂交后代新株系进行鉴定，以期为秋石斛杂种后代的早期选择及新品种（系）的快速鉴定提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

以秋石斛四面佛、水芙蓉及其17个杂交后代新株系（编号：1～17）为试验材料，供试材料均取自福建省农业科学院作物研究所特色兰花工程化实验室育种圃。试验于2020年11月在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉分子实验室进行。

1.2 试验方法

1.2.1 叶片总DNA的提取 采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法进行秋石斛亲本及其杂交后代新株系叶片总DNA的提取，经1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测其完整性和纯度后，将DNA产物于-20 ℃条件下保存备用。

1.2.2 秋石斛SRAP-PCR扩增的体系和程序 基于笔者所在课题组前期的研究结果[8]，利用筛选出的能在48份石斛兰中扩增出清晰条带的14对引物组合对供试材料进行PCR扩增。PCR反应体系的总体积为50 μL，包括5.0 μL含Mg2+的Buffer，4.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.5 μL 5 U/μL Taq聚合酶，2.0 μL 50 ng/μL模板DNA，各2.0 μL上游、下游引物，34.5 μL ddH2O。采用变温复性反应程序进行PCR扩增，通过2.5%琼脂糖凝胶电泳分离产物，获得电泳图谱后拍照保存。

1.2.3 秋石斛杂交后代真实性的鉴定 从14对SRAP引物组合中筛选出具有父本特征条带的引物组合，利用筛选出的引物组合对杂交后代群体进行鉴别，将具有父本特征条带的杂种鉴定为真杂种。

1.2.4 数据分析 观察分析电泳图谱，对其中的DNA条带数进行统计，在同一迁移位置上有扩增条带的记作1，无条带的则记作0，在Excel中构建1、0原始数据矩阵。基于数据矩阵，利用Excel计算引物的多态性比率，利用NTSYS-pc2.10e软件绘制亲本与杂交后代间的遗传距离矩阵与遗传相似系数矩阵。而后根据遗传距离矩阵进行聚类分析，获得聚类图;根据相似系数矩阵，在Excel中绘制亲本与杂种间的遗传相似系数箱式图。

2 结果与分析

2.1 秋石斛SRAP引物的初筛选

将19份供试材料的DNA浓度稀释至同一水平后，随机选择2个杂交后代的新株系样本进行14对SRAP引物组合的初步筛选，筛选出8对能够扩增出明显条带的引物。随后，利用这8对引物组合对供试的19个样品进行扩增，发现有5对SRAP引物组合（Me1+Em2、Me1+Em3、Me1+Em8、Me4+Em2及Me6+Em6）能扩增出清晰条带，且父本能扩增出母本没有的特异性条带（表1）。

2.2 杂交后代的真实性鉴定

利用筛选出的5对SRAP引物组合对17个杂交后代新株系进行真实性鉴定（表2），其中能扩增出具有父本特异性条带的新株系便是真杂种，否则为假杂种。结果表明，在Me1+Em8和Me6+Em6引物组合的扩增结果中，鉴定出有16个杂交后代新株系为真杂种，鉴定效率达94.12;而Me1+Em2、Me1+Em3、Me4+Em2引物组合检测到10、12、11个杂交后代新株系具有父本特异条带，鉴定效率分别为58.82%、70.59%和64.71%。此外，在Me1+Em8引物组合中未检测到5号杂交后代新株系具有父本特异条带;而在Me1+Em2引物组合的扩增结果中（图1），发现5号杂交后代新株系具有父本特征条带，鉴定其为真杂种;Me1+Em3、Me4+Em2及Me6+Em6引物组合中同样鉴定出5号杂交后代新株系，为真杂种。综合5对引物组合的扩增结果，供试的17个秋石斛杂交后代新株系均具有父本特异性条带，鉴定为真杂种，鉴定效率达到100%。

2.3 SRAP引物的多态性分析

从图1可以看出，秋石斛不同杂交后代株系间的SRAP存在多态性，因此对筛选出的5对SRAP引物组合进行多态性分析。由表3可以看出，5对引物组合共扩增出26个条带，其中多态性条带数有23个，平均每对引物组合扩增到4.6个多态性条带，多态性位点比例为88.46%。Me1+Em2、Me1+Em8及Me4+Em2引物组合的多态性比例均为100.00%，Me6+Em6引物组合的多态性比例仅为71.43%。

2.4 亲本与杂交后代的聚类分析

根据统计结果建立0，1型数据，利用NTSYS-pc2.10e软件构建秋石斛亲本与杂交后代的聚类图。从图2可以看出，19个供试材料间的遗传距离为0.05～0.27，其中2号杂交后代新株系与4号杂交后代新株系间的遗传距离最近。在遗传距离0.23处，19个供试秋石斛材料被分为3大聚类群：第Ⅰ类，包含母本四面佛、17号杂交后代新株系;第Ⅱ类，包含15个杂交后代新株系，有1～5号杂交后代新株系及7～16号杂交后代新株系，占供试杂交后代新株系的88.24%;第Ⅲ类，包含父本水芙蓉和6号杂交后代新株系。

2.5 杂交亲本与后代的遗传相似系分析

根据NTSYS-pc2.10e软件构建的秋石斛亲本与杂交后代的遗传相似系数矩阵，其中母本四面佛与父本水芙蓉间的遗传相似系数仅为0.46，为遗传相似系数矩阵中的最低值。基于遗传相似系数矩阵，绘制亲本与杂交后代的遗传相似系数箱式图。由图3可以看出，母本四面佛与杂交后代新株系间的遗传相似系数为0.62～0.85，其中母本四面佛与3号杂交后代新株系间的遗传相似系数最高，与6

号杂交后代新株系间的遗传相似系数最低，母本四面佛与杂交后代新株系间的平均遗传相似系数为0.72。父本水芙蓉与杂交后代新株系间的遗传相似系数为0.54～0.85，其中父本水芙蓉与6号杂交后代新株系间的遗传相似系数最高，与3号杂交后代新株系间的遗传相似系数最低，父本水芙蓉与杂交后代新株系间的平均遗传相似系数为0.66。杂交后代与母本的遗传相似系数较父本的大，说明杂交后代与母本的亲缘关系更近，表现为偏母性遗传，这与聚类分析中绝大多数杂交后代新株系在遺传上先倾向于母本后倾向于父本的结果相吻合。

对17个杂交后代新株系间的遗传相似系数进行分析发现，5号杂交后代新株系与15号杂交后代新株系间、5号杂交后代新株系与17号杂交后代新株系间、14号杂交后代新株系与15号杂交后代新株系间的遗传相似系数最低，为0.62;2号杂交后代新株系与4号杂交后代新株系间、4号杂交后代新株系与11号杂交后代新株系间、7号杂交后代新株系与10号杂交后代新株系间、9号杂交后代新株系与12号杂交后代新株系间、12号杂交后代新株系与14号杂交后代新株系间的遗传相似系数最高，为0.92。17个杂交后代新株系间的平均遗传相似系数为0.79，高于杂交后代与父母本间的遗传相似系数。

3 结论与讨论

SRAP分子标记技术因具有较高的重复性和共显性，且引物开发成本较低，目前已被成功应用于多种植物杂交后代真实性鉴定和遗传多样性分析中[9-12]。本研究共筛选出5对SRAP引物组合用于秋石斛杂交后代的真实性鉴定研究。结果表明，供试的17个杂交后代新株系均鉴定为真杂种，鉴定效率为100%，说明SRAP分子标记技术应用于秋石斛杂交后代真实性鉴定研究中是可行的。李玉萍等利用SRAP分子标记技术对春兰与大花蕙兰杂种株系进行早期鉴定，证实了SRAP分子标记作为兰花育种中早期杂交种筛选鉴定的有效性[13]。在杂交后代真实性鉴定的过程中，发现引物组合Me1+Em2鉴定出的真杂种数量为10个，未鉴定出1号、3号、8号、13号、15号、16号及17号杂交后代新株系，引物组合Me1+Em8鉴定出16个真杂种，鉴定出7个未在Me1+Em2引物组合鉴定出的杂交后代新株系，但未鉴定出5号杂交后代新株系，说明用不同引物组合鉴定的结果存在差异，因此，利用多对引物组合的互补作用进行鉴定，结果更为可靠[14]。

本研究利用筛选出的5对SRAP引物组合对秋石斛亲本及其杂交后代进行PCR扩增，并对其多态性进行分析，发现多态性条带占比为88.46%，与洋葱的87%[15]和苹果的89.77%[16]相当，说明供试19个秋石斛样本具有较高的遗传多样性。聚类分析结果显示，17号杂交后代新株系与母本四面佛间的亲缘关系较近，对其表型性状进行观测发现，二者均为紫色系花;6号杂交后代新株系与父本水芙蓉间的亲缘关系较近，表型性状观测结果显示，二者在花型上具有较大相似性，萼片均为椭圆形;其余15个杂交后代新株系在亲缘关系上先倾向于母本后倾向于父本。对秋石斛亲本与杂交后代的遗传相似系数分析发现，杂交后代新株系间的遗传相似系数高于杂交后代与亲本间的遗传相似系数，且杂交后代与母本的遗传相似系数较父本的大，说明该组合杂交后代的遗传基础趋向于变窄[17]，且表现为偏母性遗传，与聚类结果相印证。上述结果表明，SRAP分子标记可较准确地反映秋石斛17个杂交后代新株系与秋石斛亲本间的差异，且聚类结果与花色、花型等有较大相关性。

杂种鉴定是育种的基础工作之一，对杂种后代群体进行及时有效的鉴定可提高育种效率，对秋石斛新品种选育具有重要作用。本研究利用SRAP分子标记技术对秋石斛杂交后代新株系的真实性进行鉴定，并从分子水平探讨了不同杂交后代新株系间及杂交后代新株系与亲本间的亲缘关系远近，取得了较好的效果，为秋石斛杂交后代真实性的鉴定、种质资源评价提供了技术支撑。鉴定出的真杂种后代加快了秋石斛新品种的选育进程，可为秋石斛品种的进一步开发利用提供优良种质。

参考文献：

[1]高小坤. 秋石斛品种资源的评价与筛选[J]. 山东林业科技，2018，48（5）：9-13.

[2]陆顺教，何嘉琦，易双双，等. 秋石斛‘三亚阳光中苗低温胁迫生理响应研究及耐寒指标筛选[J]. 热带作物学报，2021，42（1）：116-122.

[3]马孟莉，张婷婷，朱玉逍，等. 利用SRAP标记分析草果遗传多样性[J]. 分子植物育种，2020，18（16）：5428-5435.

[4]刘颖鑫，李沛曈，迟天华，等. 菊花脑×甘菊种间F1杂种的鉴定和遗传多样性分析[J]. 园艺学报，2019，46（8）：1553-1564.

[5]孫宇明，冯丽媛，李琬玥，等. SRAP分子标记鉴定百合杂交后代[J]. 上海交通大学学报（农业科学版），2015，33（1）：53-58.

[6]刘雪骄，王明玖，索荣臻. 利用SRAP分子标记鉴定内蒙古栽培大豆与野生大豆杂交后代真实性[J]. 大豆科学，2017，36（2）：193-198.

[7]袁卫明，宋虎卫，杨益花，等. 枇杷SRAP标记体系优化及对枇杷矮化杂交种的鉴定[J]. 江苏农业科学，2015，43（12）：36-40.

[8]林榕燕，叶秀仙，钟淮钦，等. 基于SRAP分子标记的石斛兰种质资源遗传多样性分析[J]. 福建农业学报，2018，33（5）：469-473.

[9]Zhao X P，Zou G F，Zhao J，et al. Genetic relationships and diversity among populations of Paris polyphylla assessed using SCoT and SRAP markers[J]. Physiology and Molecular Biology of Plants：an International Journal of Functional Plant Biology，2020，26（6）：1281-1293.

[10]杨柳燕，杨 贞，蔡友铭，等. SRAP分子标记在铁皮石斛后代品种鉴定中的应用[J]. 分子植物育种，2018，16（17）：5690-5695.

[11]侯祥文，徐诗涛，王德立，等. 海南岛鸟巢蕨自然种群遗传多样性SRAP分析[J]. 热带生物学报，2021，12（1）：25-32.

[12]Bhatt J，Kumar S，Patel S，et al. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP） markers based genetic diversity analysis of cumin genotypes[J]. Annals of Agrarian Science，2017，15（4）：434-438.

[13]李玉萍，罗凤霞，汤庚国，等. 兰花杂交育种中杂种F1的早期鉴定[J]. 核农学报，2016，30（4）：676-684.

[14]高轶静，方锋学，刘昔辉，等. 甘蔗与斑茅割手密复合体杂交后代的分子标记鉴定[J]. 植物遗传资源学报，2012，13（5）：912-916.

[15]刘湘萍，杜敏霞，赵 彦，等. 洋葱种质资源遗传多样性的SRAP和ISSR分析[J]. 中国蔬菜，2021（3）：43-49.

[16]李慧峰，冉 昆，王 涛. 利用SRAP标记构建山东省苹果资源指纹图谱[J]. 沈阳农业大学学报，2020，51（4）：470-475.

[17]吴洋洋，仰小东，杨信程，等. 菊花不完全双列杂交F1代遗传关系的SRAP分析[J]. 园艺学报，2017，44（6）：1116-1124.