发育期间乳鸽血清代谢物及代谢通路的变化

2021-12-08王雪敏

动物营养学报 2021年11期

安勇计峰王雪敏王铮张帅

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056000；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所，北京 100089)

鸽(Columbaliviadomestica)属于鸟纲，鸽形目，鸠鸽科，鸽属，是一种较早被人类驯养的鸟类[1-2]。鸽肉和鸽蛋营养价值丰富，具有多种药用功效，民间素有“一鸽胜九鸡”的说法，因此近年来鸽已发展为我国第四大家禽[3]。与其他家禽不同的是，鸽作为晚成鸟，出壳后的乳鸽最初无法独立进食，必须依靠亲鸽通过口对口逆呕式哺喂才能存活[4-6]。鸽乳是由亲鸽嗉囊组织分泌的一种富含营养成分的乳酪状物质，随着乳鸽日龄的增长，鸽乳逐渐与亲鸽摄食的谷物混合，最后鸽乳完全被谷物取代[7-9]。已有研究表明，14日龄是乳鸽生长发育的重要转折点，14日龄后乳鸽的生长强度和生长速度均有所下降[10]。谢鹏等[11]研究发现，21日龄时亲鸽分泌的鸽乳减少，这是乳鸽后期生长速度变慢的主要原因。然而，现有研究多集中于哺育期亲鸽生理状态的变化，对乳鸽生长发育期的代谢物特点研究较少。因此，本试验应用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术对14和21日龄乳鸽血清中代谢物进行检测，以了解乳鸽发育期生理状态的变化，为生产中更好地满足其营养需要提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验选取14日龄、体重(398.33±43.2)g与21日龄、体重(449.17±49.44)g的健康乳鸽各6只，试验乳鸽来自北京市密云区鸽场。12只乳鸽由亲鸽哺喂(2+2模式)，按照日龄分为2组，每组6个重复，每个重复1只，于同一舍饲养，统一饲喂玉米、豌豆、高粱和小麦为基础的配合饲料，自由采食和饮水，按常规进行饲养管理，每天光照16 h，舍内温度控制在(22±6)℃。

1.2 样品采集

从乳鸽的翅静脉进行无菌采血，然后在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min后取血清，于-80 ℃保存以备检测。

1.3 试剂与仪器

主要试剂：甲醇(Fisher公司，美国)、乙腈(Fisher公司，美国)、甲酸(Fisher公司，美国)、纯水(Fisher公司，美国)、丙醇(Fisher公司，美国)，以上试剂均为色谱纯。

主要仪器：Triple TOF5600三重四级杆质谱(AB Sciex公司，美国)、ExionLC AD液相色谱系统(AB Sciex公司，美国)、HSS T3色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm，Waters公司，美国)、JXDC-20型氮气吹扫仪(上海净信实业发展有限公司)、LNG-T88型台式快速离心浓缩干燥器(太仓市华美生化仪器厂)、Wonbio-96c型高通量组织破碎仪(上海万柏生物科技有限公司)、SBL-10TD型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、Centrifuge 5430R型高速冷冻离心机(Eppendorf公司，德国)、NewClassic MF MS105DU型电子天平(梅特勒公司，瑞士)。

1.4 样本制备

取100 μL血清样本于2 mL离心管中，加入1颗直径6 mm的研磨珠。用400 μL提取液(甲醇∶水=4∶1，体积比)含0.02 mg/mL的内标(L-2-氯苯丙氨酸)提取代谢物。样本溶液于高通量组织破碎仪研磨6 min(-10 ℃，50 Hz)，然后低温超声提取30 min(5 ℃，40 kHz)。将样本于-20 ℃静置30 min，再离心15 min(4 ℃，13 000×g)，最后移取上清液上机分析。

1.5 质控(QC)样本

取等体积的所有样本提取物混合制备成QC样本，在仪器分析过程中，每6个样本中插入1个QC样本，以考察整个分析过程的重复性。

1.6 液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析

仪器平台为AB SCIEX公司的超高效液相色谱串联飞行时间质谱(UPLC-Triple TOF)系统。

1.6.1 色谱条件

10 μL样本经HSS T3色谱柱(1.8 μm，2.1 mm×100 mm)分离后进入质谱检测。流动相A为95%水+5%乙腈(含0.1%甲酸)，流动相B为47.5%乙腈+47.5%异丙醇+5%水(含0.1%甲酸)。分离梯度：0～0.1 min，流动相B从线性0升至5%；0.1～2.0 min，流动相B从线性5%升至25%；2～9 min，流动相B线性从25%升至100%；9～13 min，流动相B线性维持100%；13.0～13.1 min，流动相B线性从100%降至0；13.1～16.0 min，流动相B线性维持0。流速为0.40 mL/min，柱温为40 ℃。

1.6.2 质谱条件

样本质谱信号采集采用正负离子扫描模式，质量扫描范围质荷比(m/z)：50～1 000。离子喷雾电压，正离子电压5 000 V，负离子电压-4 000 V，去簇电压80 V，喷雾气50 psi，辅助加热气50 psi，气帘气30 psi，离子源加热温度550 ℃，(40±20)V循环碰撞能。

1.7 数据预处理和搜库

上机完成之后，LC-MS原始数据导入代谢组学处理软件Progenesis QI(Waters公司，美国)进行基线过滤、峰识别、积分、保留时间校正、峰对齐，最终得到一个保留时间、质荷比和峰强度的数据矩阵，数据矩阵用80%规则来去除缺失值，再进行空缺值填补(原始矩阵中最小值填补空缺值)，为减小样本制备及仪器不稳定带来的误差，用总和归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化，得到归一化后的数据矩阵。同时删除QC样本相对标准偏差(RSD)>30%的变量，并进行log10对数化处理，得到最终用于后续分析的数据矩阵。同时将MS和MS/MS质谱信息与代谢公共数据库HMDB(http：//www.hmdb.ca/)和Metlin数据库(https：//metlin.scripps.edu/)进行匹配，得到代谢物信息。

1.8 统计与分析

预处理后的数据上传美吉生物云平台(https：//cloud.majorbio.com)进行数据分析。利用R软件包ropls(Version1.6.2)进行主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判别分析(OPLS-DA)，并使用7次循环交互验证来评估模型的稳定性。此外，进行student’st检验分析。差异代谢物的选择基于OPLS-DA模型得到的变量投影重要度(VIP)和student’st检验P值来确定，VIP>1、P<0.05的代谢物为差异代谢物，并通过KEGG数据库(https：//www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行代谢通路注释，获得差异代谢物参与的通路。利用Python软件包scipy(version 1.0.0)进行通路富集分析，并通过Fisher精确检验获得与试验处理最相关的生物学途径。

2 结果与分析

2.1 LC-MS数据的特征

在14和21日龄乳鸽血清样本中共提取到11 538个质谱峰。经搜库(自建库、Metlin、HMDB等数据库)定性分析，共鉴定出694种代谢物，其中正离子模式鉴定到332种代谢物，负离子模式鉴定到362种代谢物。

2.2 PCA

通过PCA可初步了解组间整体代谢差异和组内的重复稳定性，PCA结果可以显示样本间代谢组的分离趋势，反映了样本间代谢组的差异大小。由图1可知，PCA模型中QC样本紧密聚集在一起，表明本试验稳定性和重复性较好。2组样本之间有明显的分离趋势，说明2组样本的代谢产物存在差异，且样本全部处于95%置信区间内。R2X为决定PCA模型质量的主要参数，PCA正离子模型和负离子模型的R2X分别为0.669、0.533，2个参数值均大于0.5，说明PCA模型良好。

A：正离子模型PCA得分图 PCA score graph of the positive ion model；B：负离子模型PCA得分图 PCA score graph of the negative ion model。D0_14:14日龄乳鸽 14-day-old pigeon；D0_21:21日龄乳鸽 21-day-old pigeon；QC:质控样本 quality control sample。下图同the same as below。图1 14与21日龄乳鸽血清样本正、负离子模型PCA得分图。Fig.1 PCA score graphs of positive and negative ion models of serum samples from 14-and 21-day-old squabs

2.3 OPLS-DA

OPLS-DA是代谢组学数据分析中常用方法，是最小偏二乘判别分析(PLS-DA)的扩展。OPLS-DA能够将PCA中不相关的差异信息去除，然后筛选差异代谢物。OPLS-DA模型得分图(图2)显示，2组样本均在95%的置信区间内，14日龄组和21日龄组分别分布在第1主成分(PC1)的左侧和右侧，说明2组样本之间存在差异。对于OPLS-DA正离子模型，R2X=0.699、R2Y=0.996、Q2=0.370；对于OPLS-DA负离子模型，R2X=0.480、R2Y=0.996、Q2=0.507，其中R2X和R2Y分别表示所建模型对X和Y矩阵的解释率，Q2表示模型的预测能力。理论上R2、Q2数值越接近1，说明模型越好，数值低则说明模型的拟合准确性差。通常情况下，R2、Q2高于0.5较好，高于0.3即可接受，从图2可知该模型具有较高的解释力和预测力。为了验证OPLS-DA模型是否存在过拟合，对模型进行验证，以确保后续结果可靠，设置检验为200次，验证模型结果(图3)显示Q2截距小于R2，且Q2回归直线呈现左低右高的趋势，表明OPLS-DA模型稳健可靠，未发生过拟合，可进一步根据VIP分析筛选差异代谢物。

A：正离子模型OPLS-DA得分图 OPLS-DA score graph of the positive ion model；B：负离子模型OPLS-DA得分图 OPLS-DA score graph of the negative ion model。图2 14和21日龄乳鸽血清样本正、负离子模型OPLS-DA得分图Fig.2 OPLS-DA score graphs of positive and negative ion models of serum samples from 14-and 21-day-old squabs

A:正离子模型置换检验图 displacement inspection chart of positive ion mode；B:负离子模型置换检验图 displacement inspection chart of negative ion mode。图3 14和21日龄乳鸽血清样本OPLS-DA模型置换检验图Fig.3 OPLS-DA model replacement test chart of serum samples from 14-and 21-day-old squabs

2.4 差异代谢物的筛选

通过OPLS-DA模型PC1的VIP及独立样本t检验的P值，寻找2个日龄乳鸽血清中的差异性表达代谢物。设置限定条件为VIP>1、FC>1或FC<1且P<0.05，筛选出的差异代谢物如表1所示。在14与21日龄乳鸽血清样本中共筛选出71种差异代谢物(38种正离子化差异代谢物和33种负离子化差异代谢物)，其中有49种丰度显著上调(P<0.05)，22种丰度显著下调(P<0.05)。根据HMDB数据库化合物分类可将差异代谢物归为如下6种类型：类脂类分子(35种)、有机杂环化合物(6种)、有机酸及其衍生物(5种)、苯基丙氨酸和聚酮(5种)、有机氧化合物(4种)、核苷酸类似物(2种)。

表1 14和21日龄乳鸽血清中的差异代谢物Table 1 Differential metabolites in serum of 14 and 21 day-old squabs

续表1序号No.差异代谢物Differentialmetabolites变量投影重要度VIP差异倍数FCP值P-value8磷脂酰胆碱[18∶2(9Z,12Z)/20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)]PC[18∶2(9Z,12Z)/20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)]1.121.040.0249反式,反式黏糠酸Trans-trans-muconicacid1.481.100.00510JanthitremC1.031.040.03911溶血磷脂酰胆碱[22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)]LysoPC[22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)]1.271.050.01212溶血磷脂酰胆碱(O-18∶0)LysoPC(O-18∶0)1.151.050.03813甘油磷酸胆碱Glycerophosphocholine1.221.080.029144′-羟基-R-苯丙酮4′-hydroxy-R-phenprocoumon1.371.120.03115诺孕酯Norgestimate1.010.950.0151616-溴-9E-十六碳烯酸16-bromo-9E-hexadecenoicacid2.161.450.02717Rieslingacetal1.160.860.03718棕榈酰左旋肉碱Palmitoyl-L-carnitine1.261.070.03319草木犀甙Melilotin2.751.790.00820溶血磷脂乙醇胺[20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0]LysoPE[20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0∶0]1.161.050.01321溶血磷脂酰胆碱[18∶2(9Z,12Z)]LysoPC[18∶2(9Z,12Z)]2.561.470.00822N-油酰基甘氨酸N-oleoylglycine3.232.380.00723D-葡萄糖基二氢鞘氨醇D-glucosyldihydrosphingosine1.691.190.03324BakkenolideB2.271.610.0482512-OAHSA3.514.240.00226神经酰胺(d18∶1/22∶0)Ceramide(d18∶1/22∶0)1.001.050.04827磷脂酰乙醇胺[22∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]PE[22∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]1.541.170.03628鞘磷脂(d18∶1/14∶0)SM(d18∶1/14∶0)1.291.120.04829磷脂酰丝氨酸[16∶0/24∶1(15Z)]PS[16∶0/24∶1(15Z)]1.581.200.02530硬脂酰肉碱Stearoylcarnitine1.221.070.03631心磷脂[a-13∶0/i-24∶0/18∶2(9Z,11Z)/i-20∶0][rac]CL[a-13∶0/i-24∶0/18∶2(9Z,11Z)/i-20∶0][rac]1.320.920.02632油酰基肉碱Oleoylcarnitine1.441.070.01233(±)-Myristoylcarnitine1.811.160.00334癸酰基左旋肉碱Decanoyl-L-carnitine2.922.390.01435羟脯氨酰异亮氨酸Hydroxyprolyl-isoleucine1.060.940.01036异丁酰肉碱Isobutyrylcarnitine1.821.290.01937蜀黍苷Dhurrin2.060.680.028383-ethyl-2-(1-pyrrolidinyl)-2-cyclopenten-1-one1.820.780.0263917-十八碳炔酸17-octadecynoicacid1.241.040.01840谷氨酸组氨酸Histidinyl-glutamate2.170.670.02941山茶皂甙元BCamelliageninB2.140.680.02442磷脂酰丝氨酸[20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/24∶1(15Z)]PS[20∶5(5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)/24∶1(15Z)]1.101.050.02243环氧樟脑醛Epoxycampholenicaldehyde1.481.220.01744N-阿魏酰基色胺Nb-feruloyltryptamine2.300.670.044

续表1序号No.差异代谢物Differentialmetabolites变量投影重要度VIP差异倍数FCP值P-value45(E)-8-羟基-2-辛烯-4,6-二炔酸(E)-8-hydroxy-2-octene-4,6-diynoicacid1.721.130.01246肌腱蛋白1-3Kinetensin1-31.581.170.00347S-腺苷蛋氨酸S-adenosylmethionine1.601.120.015482-(阿拉伯糖基氨基)-3-(葡糖基氨基)丙烷腈2-(arabinosylamino)-3-(glucosylamino)propanenitrile1.751.100.00049磷脂酰乙醇胺[15∶0/20∶2(11Z,14Z)]PE[15∶0/20∶2(11Z,14Z)]1.490.940.03050脱氧尿苷Deoxyuridine2.031.440.02251磷脂酰乙醇胺[P-16∶0/14∶1(9Z)]PE[P-16∶0/14∶1(9Z)]2.111.300.02452溶血磷脂酰胆碱(16∶0)LysoPC(16∶0)1.930.790.009535,7-二羟基-2’,6-二甲氧基异黄酮-7-鼠李糖苷5,7-dihydroxy-2’,6-dimethoxyisoflavone-7-rhamnoside1.771.180.02754红藻胶Furcelleran1.531.200.04855L-棕榈酰肉碱L-palmitoylcarnitine2.701.970.0235620-羟基-PGF2a20-hydroxy-PGF2a2.541.900.019573-dehydrosphinganinium(1+)1.641.310.034581-棕榈酰甘油磷酸肌醇1-palmitoylglycerophosphoinositol1.071.080.01859Taraxacolide1-O-b-D-glucopyranoside1.250.880.03560十二烷基肉碱Dodecanoylcarnitine2.622.000.01061磷脂酰丝氨酸[18∶1(11Z)/20∶2(11Z,14Z)]PS[18∶1(11Z)/20∶2(11Z,14Z)]2.000.740.04162矮牵牛花素3-龙胆二糖苷Petunidin3-gentiobioside2.391.590.039639,12-十六烷二酰基肉碱9,12-hexadecadienoylcarnitine1.720.780.01664HebevinosideX2.130.720.037654-羟基苯甲醛4-hydroxybenzaldehyde1.410.900.01966谷氨酰色氨酸Glutamyltryptophan1.541.100.01667磺酰胆碱甘氨酸Sulfolithocholylglycine1.650.870.04868乙丙嗪Ethopropazine1.870.850.027693-甲基二氧吲哚3-methyldioxyindole1.760.780.046703-甲基戊二酸3-methylglutaricacid1.680.820.00271多巴醌Dopaquinone1.520.890.033

2.5 KEGG通路富集分析

利用KEGG数据库对差异代谢物进行注释，发现14与21日龄乳鸽血清样本中71种具有显著差异的代谢物共注释到29条代谢通路。由表2可知，富集差异代谢物较多且显著的通路主要有甘油脂代谢、醚脂代谢、糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成。

表2 14与21日龄乳鸽血清差异代谢物KEGG通路富集分析Table 2 Enrichment analysis of KEGG pathway in serum of 14-and 21-day-old squabs

3 讨论

代谢组学是对生物体代谢物进行定性定量分析，并寻找代谢物与生理和病理变化相对关系的研究[12]。按研究的目的，代谢组学又可分靶向和非靶向，其中非靶向代谢组学能从整体反映代谢物的变化，全面地挖掘小分子代谢物，有利于发现新的代谢物和新的代谢通路[13]。利用非靶向代谢组学技术对14和21日龄乳鸽血清样本进行分析，总共筛选出71个显著差异代谢物，包括类脂类分子(35种)、有机杂环化合物(6种)、有机酸及其衍生物(5种)、苯基丙氨酸和聚酮(5种)、有机氧化合物(4种)、核苷酸类似物(2种)。

S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)是蛋氨酸的活性形式，为机体内重要的甲基供体，参与DNA、RNA、脂质和神经递质等化合物的甲基化反应[14]。SAM在机体生理功能和生化反应中起到不可替代的重要代谢与调控作用[15]。此外，SAM直接参与多胺的形成，促进细胞的生长和蛋白质的合成[16]。蛋白质是生长发育最基本的营养成分之一，本试验中，与14日龄乳鸽相比，21日龄乳鸽血清中SAM含量显著上调，这可能表明随着日龄增长机体蛋白质的合成增加。冯艳等[17]研究指出，SAM可以调控肌肉发育，通过促进蛋白质合成并抑制其降解，使其在体内沉积,从而提高畜禽骨骼肌肌肉产量。另有研究表明，饲粮中添加蛋氨酸可以显著提高乳鸽的胸肌和腿肌的产量[18]，这可能与SAM促进肌肉发育的作用相关。他人关于乳鸽生长规律的研究也发现，乳鸽在21日龄较14日龄胸肌产量有显著提高[19]，这与本试验中21日龄乳鸽血清中SAM含量显著增加相符合。但SAM在乳鸽体内的作用方式及机理还有待进一步研究。

肉碱是一种在肝脏、肾脏和大脑中合成的类维生素化合物，是动物脂肪酸代谢的一个重要因素[20]。已知肉碱最重要的代谢功能是将脂肪转运到细胞的线粒体中进行脂肪酸氧化[21]。L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱是肉碱的长链酰基脂肪酸衍生酯。与14日龄乳鸽相比，21日龄乳鸽血清L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱的含量显著增加，这表明乳鸽生长后期脂肪酸氧化增强，从而释放能量供乳鸽生长发育利用。

本试验中代谢物KEGG注释化合物分类最多的是磷脂类，主要有溶血磷脂酰胆碱[20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)]、溶血磷脂酰胆碱(P-18∶0)、磷脂酰胆碱[18∶2(9Z,12Z)/20∶4(8Z,11Z,14Z,17Z)]、溶血磷脂酰胆碱[22∶4(7Z,10Z,13Z,16Z)]、溶血磷脂酰胆碱[18∶2(9Z,12Z)]、磷脂酰乙醇胺[22∶5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z)/22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)]、磷脂酰乙醇胺[15∶0/20∶2(11Z,14Z)]、溶血磷脂酰胆碱(16∶0)。磷脂是构成生物膜脂质双层结构的主要成分，具有抗氧化、刺激细胞生长、免疫调节、促进羽毛生长等生理作用[22-23]。在生产实践中发现，乳鸽在后期生长发育过程中羽毛生长速度最快。除磷脂酰乙醇胺[15∶0/20∶2(11Z,14Z)]、溶血磷脂酰胆碱(16∶0)外，其余6种代谢物在21日龄乳鸽血清中的丰度均显著上调。这可能与乳鸽生长发育后期代谢生成大量磷脂以满足羽毛快速生长有关。综上所述，乳鸽发育后期(14～21日龄)血清中S-腺苷蛋氨酸、L-棕榈酰肉碱、硬脂酰肉碱和磷脂类代谢物质发生了显著的变化。上述结果有助于了解乳鸽发育期生理状态的变化，为生产中更好地满足其营养需要提供参考。