苗药天门冬对结直肠癌LOVO细胞增殖和迁移的影响

梁惠玲 钟家友 王飞清 李艳菊 赵嘉宁 杨姁 刘燕青 安仕刚 刘洋

(1贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2贵州中医药大学第一附属医院；3贵州医科大学附属医院)

结直肠癌是严重危害人类消化系统的恶性侵袭性肿瘤，其发病隐匿、恶变率高、病程速度快、复发率高〔1〕。我国每年新发病例已超过17万，并且每年以4.2%的速度增长，远超2%的国际增长水平〔2～4〕。结直肠癌治疗手段主要以手术、放化疗及中草药抗肿瘤为主，但结直肠癌的治疗及预后并不理想，术后的复发和转移是结肠癌患者死亡的主要因素〔5～7〕。近年大力挖掘地方民族医药防治结直肠癌是很多学者关注的重点，以期为攻克结直肠癌这一重大肿瘤疾病提供线索。多年生草本天门冬因其富含皂苷、黄酮、微量元素等多种成分，现作为重点发展的贵州传统苗药材得以大力种植。研究证实苗药天门冬是一种具有抗肿瘤、抗氧化、增加人体免疫力等功效的天然药物〔8～10〕。为此，本研究通过细胞水平验证贵州天然苗药天门冬作用于结直肠癌LOVO细胞的生物学效应，其增殖、迁移及P53和P21基因表达水平，为结直肠癌的治疗和新药开发开拓思路。

1 材料与方法

1.1材料 LOVO结直肠癌细胞系由中国科学院上海细胞生物所提供，胎牛血清(以色列BI公司，批号：04-001-1ACS)，细胞培养基高糖(H)-DMEM(美国GIBCO公司)，含乙二胺四乙酸(EDTA)0.25%胰蛋白酶：碧云天生物科技有限公司产品，PCR试剂盒：全式金生物公司，CCK-8试剂盒：日本同仁公司，Trizol试剂盒：Invitrogen公司，二甲基亚砜(DMSO)：索莱宝公司，结晶紫染液：索莱宝公司。

1.2主要仪器 超净工作台(苏州净化设备公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；Olympus显微镜(日本奥林巴斯公司)；Leica DMI6000 B电动倒置荧光相差显微镜(莱卡公司)；全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司)。

1.3天门冬水煎剂制备 天门冬水煎剂制备：精密称取天门冬50 g，加10倍量水称重，回流提取2次，1 h/次，抽滤，用水补足减少的重量，药液在70℃减压浓缩，得浓度为1 g/ml天冬水提取液，取浓缩液1 ml加水稀释至5 ml，1 000 r/min离心5 min，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤，滤液作为实验应用，LOVO细胞给药浓度为40 μl/ml H-DMEM培养基。

1.4细胞培养与传代 将LOVO细胞置于37℃，饱和湿度5% CO2培养箱中常规培养。培养均用含10%热灭活胎牛血清，1%的抗生素(青霉素100 mg/L和链霉素100 mg/L)的DMEM完全培养基。细胞呈单层生长，达80%左右融合时，采用0.25%的胰酶消化液消化传代，取生长对数期的细胞用于实验。

1.5结晶紫染色 选择第3代LOVO细胞，用0.25%胰酶消化，按照1×104个/孔的细胞密度分别接种于24孔板中，每组设有3个复孔，每孔加入细胞培养基为800 μl。待细胞贴壁生长密度达50%后，给予天门冬水煎剂40 μl/ml(天门冬组)，培养24 h进行染色，显微镜下观察细胞生长情况。以不加天门冬水煎剂为空白组。

1.6CCK-8增殖实验 选择第3代LOVO细胞，用0.25%胰酶消化，按照2×103个/孔的细胞密度分别接种于96孔板中，每组设有6个复孔，每孔加入细胞培养基为200 μl。待细胞贴壁生长后，每隔24 h检测细胞生长情况，每孔加入20 μl CCK-8试剂，3 h后用酶标仪(波长450 nm)检测吸光度值，并绘制细胞生长曲线。

1.7划痕实验 将对数生长期的LOVO细胞接种于6孔板，细胞浓度为5×104个/孔，培养24 h后细胞融合度达80%，用无菌20 μl枪头在每个孔底划出“十”字划痕，用生理盐水洗2遍，拍照记录后减血清培养基饥饿处理4 h后加入40 μl/ml天门冬水煎剂(天门冬组)，并设立空白组，继续培养24、48 h后在显微镜下观察划痕愈合度，拍照记录，并分析细胞的迁移情况。

1.8侵袭实验 天门冬作用结直肠癌细胞后，随后取出5×104细胞接种于8 μm Transwell上室，设立3个复孔，下室加入对照培养基。 孵箱中孵育12 h后，上室使用3%多聚甲醛固定10 min，吉姆萨染色15 min后，使用显微镜对迁移至上室背侧的细胞进行计数。

1.94′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)检测细胞凋亡 将LOVO细胞接种于24孔板，密度为5×104/孔，细胞接种后待细胞贴壁，去除原培养液，按实验分组加入天门冬水煎剂，空白组加入含有10%胎牛血清培养基，培养箱中孵育2 d后，多聚甲醛固定30 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，加入5 mg/L DAPI染液，5 min后用PBS冲洗3遍，显微镜下采集图像。

1.10Real-Time PCR测定细胞中P53和P21 mRNA表达 采用Trizol法提取细胞总RNA，根据试剂盒说明书具体方法进一步采用实时定量-反转录聚合酶链反应进行基因片段扩增并定量。各PCR反应管中所加模板RNA的量约为1 μg。P53和P21 PCR扩增条件为：Real-time PCR：95℃ 5 s，59℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环。熔解曲线：95℃ 5 s，65℃ 5 s，60个循环。结果通过RT PCR仪记录的Ct值对起始模板相对定量分析。

1.11数据处理 采用SPSS22.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1显微镜观察细胞形态学变化 高倍显微镜下可见空白组的细胞成群贴壁生长，细胞透亮，折光性好，核圆而大，细胞核形态正常，染色质分布均匀。天门冬组细胞之间互相脱离，与周围细胞脱离，形态改变贴壁不牢，细胞破碎，结果见图1。

图1 LOVO细胞结晶紫染色结果(×200)

2.2天门冬对LOVO细胞迁移和侵袭的影响 与空白组比较，天门冬组LOVO细胞的侵袭率明显下调〔(280.3±9.5)个 vs (176.7±15.3)个;t=9.980，P=0.001〕，见图2。通过细胞划痕实验结果显示，24 h后空白组迁移率明显高于天门冬组〔(54.67±2.52)% vs (40.33±1.53)%;t=8.433,P=0.001〕，结果进一步说明天门冬对结直肠癌细胞有较强的抑制其迁移的药效作用，见图3。

图2 天门冬作用LOVO细胞侵袭实验(×200)

图3 天门冬作用结直肠癌 LOVO细胞划痕实验(×100)

2.3天门冬对结直肠癌LOVO细胞增殖的影响 天门冬对LOVO细胞增殖具有明显的抑制作用，第3～6天天门冬组细胞增殖率显著低于空白组，结果见表1。

表1 天门冬作用结直肠癌LOVO细胞增殖率

2.4DAPI染色荧光结果 LOVO细胞发生凋亡时其细胞核呈现致密核染或呈碎块致密核染，天门冬组LOVO细胞可见明显细胞核解体的现象，且细胞密度较低，细胞凋亡率明显高于空白组(P<0.05)，见表2、图4。

图4 天门冬作用结直肠癌LOVO细胞DAPI染色结果(×100)

2.5天门冬作用LOVO细胞后凋亡基因的变化 与空白组相比，天门冬组P53和P21 mRNA的表达量明显上调(P<0.05)，见表2。

表2 两组凋亡率及P53、P21 mRNA的表达

3 讨 论

结直肠癌患者术后采用中医药配合化疗或放疗，既可相互协同杀灭肿瘤细胞，增强放化疗的敏感性，又可减少和改善放化疗的不良反应，提高放化疗的治疗效果，降低结直肠癌的复发转移率，改善患者的生活质量，延长生存期〔11〕。

天门冬作为贵州传统苗药材近年在医疗市场得以重点发展，《神农本草经》将天门冬列为上品其后历代本草均有收载，现为常用中药之一，其活性成分和药效评价一直是本课题组研究重点。我们前期研究报道贵州产天门冬明显具有对O2-和·OH的清除及抑制作用，证实了天门冬是有效的氧自由基清除剂〔12～14〕。

研究发现，细胞增殖过盛和凋亡抑制被认为是肿瘤发生和发展的关键〔15，16〕。临床中应用的抗肿瘤药主要目的是诱导肿瘤细胞凋亡，这也是药物抗肿瘤的重要机制之一〔17〕。本实验结晶紫染色和CCK-8结果显示，天门冬水煎剂作用结直肠癌LOVO细胞后，抑制LOVO细胞增殖，细胞形态发生变化。细胞划痕实验和侵袭实验结果显示，天门冬水煎剂作用结直肠癌LOVO细胞后，抑制LOVO细胞侵袭和迁移作用。通过检测细胞凋亡基因P53和P21 mRNA的表达，发现LOVO细胞在天门冬作用后P53和P21 mRNA表达明显上调，同时DAPI细胞荧光染色结果进一步证实了天门冬可促进LOVO细胞凋亡，这可能为天门冬抑制结直肠癌的重要调控机制。

综上，苗药天门冬可抑制结直肠癌LOVO细胞的增殖，侵袭，并促进LOVO细胞凋亡，其凋亡路径可能是通过天门冬作用LOVO细胞后增加P53和P21凋亡基因实现的。随着对天门冬药理作用及其机制的深入了解，这将为天门冬在临床防治肿瘤方面提供有效的基础数据支撑。