稳斑汤激活Nrf2信号通路减轻氧化应激缓解大鼠冠脉微循环障碍

张雯雯 金颂峰 赵国梁 宮丽鸿

(1辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2辽宁中医药大学附属第三医院；3辽宁中医药大学附属医院)

冠状动脉(冠脉)微循环是指微动脉、微静脉及毛细血管间的血液流通循环良好，而冠脉微循环障碍(CMD)是指上面三者构成的微循环系统被不良因素影响导致的结构和功能改变。CMD的病理机制包括血液流变学改变、血管平滑肌功能障碍、心脏神经系统失衡、氧自由基产生及冠脉内皮功能失调等〔1，2〕。研究表明冠脉微循环的结构和功能障碍会影响心肌梗死、冠心病等疾病的发生、发展及预后。虽然经皮冠脉介入治疗和搭桥手术是有效的治疗手段，但是患者术后的近期死亡率仍高达7%〔3〕。因此，保持冠脉微循环的完整性，从而改善其功能障碍显得尤为重要。研究证实中药复方对改善冠脉微循环障碍有较好功效，比如复方丹参滴丸〔4〕、麝香保心丸〔5〕等。稳斑汤作为搜风祛痰中药复方，通过干预动脉硬化不稳定斑块的形成及改善血管内皮功能和血脂在动脉粥样硬化及冠心病不稳定型心绞痛等冠脉血管病变疾病中发挥着较好的疗效〔6，7〕，但是稳斑汤是否能改善大鼠CMD未见报道。本研究旨在探讨稳斑汤对CMD的改善效果及其相关机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 30只雄性SD大鼠，4～6周龄，体重180～220 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：SCXK(辽)2010-001。所有大鼠被安置在符合SPF级标准的动物房间里，温度18～24℃，相对湿度55%～65%，亮∶暗=1∶1，可自由取用食物和水。本研究经实验动物福利伦理委员会批准。

1.1.2试剂 稳斑汤由全蝎10 g、蜈蚣2条、地龙15 g、陈皮15 g、半夏15 g、白术15 g、水蛭15 g组成，由辽宁中医药大学附属医院制剂室加工制成含生药2 g/ml的浓缩液。月桂酸钠购自Sigma公司；丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、前列腺素环(PG)I2和血栓素(TX)A2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司；TM和EPCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；预混液形式的逆转录试剂和2×实时定量聚合酶链反应(PCR)扩增的预混合溶液购自诺唯赞生物科技有限公司；兔抗Fyn、Nrf2、血红素加氧酶(HO)-1、醌氧化还原酶(NQO)1和GAPDH抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记驴抗兔IgG购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(5×)购自碧云天生物技术研究所。

1.1.3仪器 小动物呼吸机(上海玉研科学仪器)；倒置生物显微镜(德国Leica)；超低温高速离心机(Thermo)；超低温冰箱(青岛海尔)；qPCR仪(Thermo)；Western印迹电泳仪和转膜仪(Bio-Rad)；全自动酶标仪(南京德铁)。

1.2方法

1.2.1大鼠CMD模型的制备及分组 采用随机法将30只大鼠分为假手术组、模型组、稳斑汤组，每组10只。模型组、稳斑汤组制备大鼠CMD，大鼠称重并给予10%水合氯醛 (3 ml/kg)腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠取仰卧位固定，常规颈部及胸部备皮消毒，颈部正中切开皮肤钝性分离暴露气管，直视下经气管插管，连接小动物呼吸机辅助通气，于左侧第2肋间水平靠近胸骨左缘纵向切开肌肉，依次剪断第2、3、4 肋，寻找并暴露主动脉，用自制扩胸器向左右两侧扩张胸腔，使心尖部位暴露，使用一次性0.1 ml注射器由心尖部刺入左心室腔内，迅速注入月桂酸钠1 ml/kg (浓度1 mg/ml)，同时夹闭主动脉升部与主动脉弓连接处10 s，以使注入的月桂酸钠试剂顺利进入冠脉。注射完成后迅速将心脏放入胸腔，待心跳平稳后缝合肋骨和胸骨，关闭胸腔，逐层缝合肌肉、皮下组织和皮肤，待呼吸平稳后拔除气管插管。术中或术后出现心脏骤停或者呼吸停止，给予胸外心脏按压。假手术组只做暴露操作而不作任何造模处理，术后常规给予青霉素钠80万U腹腔注射预防感染。稳斑汤组给予8.55 g/kg灌胃处理，假手术组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃，连续灌胃7 d，每天1次，第8天给药后2 h取材进行以下实验〔8〕。

1.2.2苏木素-伊红(HE)染色观测各组心脏微血管变化 将从各组大鼠分离出来左心室置于4%多聚甲醛中固定，脱水、透明、石蜡包埋随后切片，厚度在4 μm左右，隔十取一，按照参考文献所示的步骤对其进行HE染色〔9〕。每组选取6张切片标本，光镜下观察心肌组织和形态学改变。

1.2.3ELISA法检测各组血清中PGI2和TXA2水平 取各组大鼠全血，用1.5 ml离心管收集起来。室温静置30 min后，3 500 r/min离心15 min，将上清(即血清)收集到新的1.5 ml离心管中。采用PGI2和TXA2试剂盒检测各组大鼠血清中PGI2和TXA2含量。

1.2.4qPCR检测各组左心室中TM和EPCR mRNA水平 用Trizol法提取各组大鼠左心室的总RNA，按逆转录试剂盒所示方法反转成cDNA；构建PCR。TM：上游引物：CCTTTGTCTTTCCGGGCTCT，下游引物：TCAAGTCCTCCCTACCCTCG；EPCR：上游引物：AACCGCACTCGGTATGAACT，下游引物：TGGCTTCACAGTGAGCTGAA；GAPDH：上游引物：TGATGGGTGTGAACCACGAG，下游引物：GCCCTTCCACAATGCCAAAG。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，变性95 ℃ 10 s，退火55 ℃ 30 s，扩增40个循环。以GAPDH作为内参。结果用Ct值表示，基因的改变用2-△△Ct值表示。

1.2.5氧化应激水平检测 各组称取一定量的左心室组织，加入9倍体积的生理盐水制成匀浆液，10 000 r/min离心5 min，取上清于新的1.5 ml离心管中作为待测样品。严格按照试剂盒说明书进行操作，测定样品中SOD、MDA、CAT和 GSH的浓度。

1.2.6Western印迹检测各组左心室中Fyn、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达 将各组大鼠左心室放入电动匀浆器中匀浆，加入蛋白裂解液和终浓度为1 mmol/L的PMSF，在冰上裂解30 min。然后将液体转移至新的1.5 ml离心管中，4℃条件下离心，取少量上清液用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。以最低浓度为标准，加入一定量裂解液将各组蛋白调整至等浓度后，用等体积的蛋白上样缓冲液稀释，SDS-PAGE分离。320 mA转膜1.5 h将胶上的蛋白转移到0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入1∶1 000稀释的Fyn、Nrf2、HO-1、NQO1和GAPDH一抗4℃ 孵育过夜，TBST洗膜3次后，加入二抗置摇床上室温孵育1 h，采用ECL发光后胶片暗室曝光显影。用Image J软件对图像进行分析，结果以目的蛋白与内参蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.3统计学分析 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1稳斑汤改善CMD大鼠冠状动脉微循环障碍 HE染色观察心肌病理组织学变化。假手术组心肌纤维排列良好，心肌细胞大小均匀，胞质染色均匀，血管壁正常，微血管无血栓形成。而模型组可见心肌细胞肥大、排列不规则、胞质不均一、核固缩、核溶解、血管壁增厚、微血管血栓形成。经稳斑汤处理后，大鼠心肌纤维排列较良好，心肌细胞肥大情况得到改善，胞质染色较均匀，血管壁增厚程度变轻，微血管中虽有血栓形成，但均得到一定程度的改善。见图1。

图1 各组心肌病理组织学(HE，×200)

2.2稳斑汤改善CMD大鼠的血管活性 与假手术组相比，模型组血清中PGI2含量显著升高，而TXA2含量显著降低(P<0.05)；给予稳斑汤治疗后的CMD大鼠血清中PGI2含量显著降低，而TXA2含量显著升高(P<0.05)，见表1。说明稳斑汤能改善CMD大鼠冠状动脉微循环障碍的血管活性。

表1 各组血清中PGI2和TXA2水平比较

2.3稳斑汤减轻大鼠冠脉微循环障碍内皮的损伤 与假手术组相比，CMD大鼠左心室中TM和EPCR mRNA水平均显著升高(P<0.05)；而经稳斑汤治疗后，CMD大鼠心脏区内皮损伤相关因子TM和EPCR mRNA水平明显降低(P<0.05)，说明稳斑汤能够减轻CMD大鼠的内皮损伤。见表2。

表2 qPCR检测各组TM、EPCR mRNA的表达

2.4稳斑汤减轻CMD大鼠心脏中氧化应激水平 与假手术组相比，模型组SOD、CAT和 GSH活性明显降低，而MDA含量显著提高(P<0.05)；与模型组相比，稳斑汤治疗组能够显著提高损伤心组织中SOD、CAT和 GSH活性(P<0.05)，显著降低MDA含量(P<0.05)，见表3。说明稳斑汤能够减轻CMD所致的氧化应激。

表3 各组心脏MDA、SOD、CAT、GSH、CAT、Fyn、Nrf2、HO-1及NQO1水平比较

2.5稳斑汤抑制CMD大鼠心脏中NRF2信号通路相关蛋白的表达 与假手术组相比，模型组Fyn水平明显升高，Nrf2、HO-1和NQO1表达量明显降低(P<0.05)；与模型组相比，稳斑汤组能降低Fyn的表达，Nrf2、HO-1和NQO1表达量明显升高(P<0.05)，见表3、图2。提示稳斑汤抑制Fyn进而激活NRF2信号通路通过抗氧化应激发挥心保护作用。

图2 各组左心室中Fyn、Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白的成像条带

3 讨 论

CMD在我国医学上虽然没有明确的命名，但是根据其发病时的特征，可将其归于胸痹和心痛症的范畴，临床上通过温阳活血、疏肝化痰的方法可治疗CMD。《金匮要略》首次提到“阳微阴弦”，说明发病的先决条件是胸阳不振和气血痹阻。现代医学在前人的总结上提出了CMD的主要发病机制为心络绌急、阳虚络瘀、肝郁气滞等，所以CMD主要治疗原则是活血通络、益气散结、疏肝化痰。中药复方稳斑汤主要功效则是搜风祛痰、活血化瘀，方中运用了搜风中药蜈蚣、全蝎、水蛭、地龙，配合化痰化瘀药法半夏、陈皮、白术。药理研究显示：蜈蚣可以降低血液黏度，使凝血时间延长，改善微循环；全蝎具有抗凝功能，起到抑制形成的功效；水蛭同全蝎一样具有抗凝功能，同时还降低血脂，消退粥样斑块；地龙可以发挥抗凝和纤溶功能；法半夏具有降脂作用；陈皮可扩张血管、增加血流量、增加心肌收缩力，同时还能降低血脂；白术可改善心肌缺血缺氧症状，也有抗凝作用〔7，10〕。本研究结果说明稳斑汤可以改善冠状动脉微循环障碍。

CMD可导致心脏缺血和心脏病发作。梗阻性冠脉疾病与CMD的主要区别是诱导的病因。梗阻性冠脉疾病主要由冠脉斑块的形成和导致缺血的血管阻塞或狭窄引起的，而CMD是由毛细血管丢失或小血管收缩增加引起的。由于CMD引起的胸痛患者的血管影像是正常的，因此CMD患者常被误诊为心肌炎等其他疾病〔11〕。PGI2和TXA2是维护血管张力、血管壁完整性等方面起着重要作用的因子，其他因素导致两者失衡会引起血管疾病；TM及EPCR是新发现的位于血管内皮细胞的两种蛋白受体，用来反映内皮细胞受损的标志。创伤后氧化应激及炎症的发生直接或间接导致血管内皮细胞受损，内皮细胞大量释放TM及EPCR〔12〕。本研究结果说明稳斑汤能改善CMD大鼠冠脉微循环障碍的血管活性，减轻血管内皮损伤。

CMD发生时氧自由基大量产生，导致心肌氧化损伤。氧自由基可引起组织脂质过氧化反应产生MDA，体内存在的天然的自由基清除系统如SOD、GSH等也会被消耗而降低。本研究结果说明稳斑汤能够减轻CMD所致的氧化应激。Nrf2是细胞对氧化应激的适应性的中心调节因子。在正常条件下，细胞内NRF2以低水平表达，主要通过泛素化和蛋白酶体降解被Fyn抑制。在活化后，Nrf2与Fyn解离，并与各种抗氧化应激应答基因的启动子区结合，如NADPH、NQO1、HO-1和NQO1，与核内的抗氧化应答元件(WAS)结合。这些酶通常通过减少过量ROS和防止细胞氧化损伤来维持细胞氧化还原稳态〔13〕。因此，Nrf2信号通路在抗氧化应激中起着重要的作用。本研究结果证实稳斑汤可以抑制Fyn进而激活NRF2信号通路通过抗氧化应激发挥保护作用。