多重PCR靶向富集结合高通量测序在子宫内膜癌MMR基因突变筛查中的应用

侯青霞 黄好亮 张 沛 周玉飞

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是女性生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国女性生殖道恶性肿瘤中位于第二位，仅次于宫颈癌，但在北京、上海、广州等部分地区，EC已成为女性生殖道恶性肿瘤的首位[1]。近来研究表明，EC发病率及死亡率将呈现上升趋势[2]。EC患者约有5%具有遗传易感性，在以EC为表现形式的遗传综合征中最为常见的是林奇综合征(Lynch syndrome，LS)，故称之为LS相关EC[3]。LS又称为遗传性非息肉性结直肠癌综合征(HNPCC)，是一种由MMR基因种系突变引起的常染色体显性遗传病。LS家族携带MMR种系突变基因的女性终生患EC的风险为60%，而非LS家族的普通人群仅为2.3%[4]。目前，EC真正的发病原因目前尚不十分清楚，研究显示约20%EC患者有家族史，表现出微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)，说明与MMR基因的突变有关[5]。LS患者常常会同时性或异时性地患有多种肿瘤，患结直肠癌的概率约80%，患EC的终生风险为40%～60%。但是在女性LS患者中，EC的几率大于或等于其发生结直肠癌的几率，并且约50%患者是以EC为首发，因此EC可以视为LS的“前哨”肿瘤[6]。目前LS的研究集中在肠癌，对肠外肿瘤尤其是女性LS高发的EC的研究非常少，临床缺乏对于EC高危人群的筛查指标，本研究采用多重PCR靶向富集结合新一代高通量测序技术对MMR基因进行检测，旨在分析MMR基因在豫西地区女性中的分布频率，评价MMR基因作为EC筛查指标的价值，深入研究MMR基因调控机制，从而为EC临床规范化治疗提供更多资料。

1 资料与方法

1.1 资料来源

选择2014年2月至2018年6月经病理学确诊为EC的86例豫西地区女性患者为研究对象。入组患者均为新发EC，年龄45～75岁。对患者的病史、家族史及临床病理特点进行详细采集，包括：EC发病时间、肿瘤分级和分期、发病部位、有无脉管瘤栓、发病时间间隔、有无糖尿病、高血压及肥胖(BMI≥28)等危险因素、癌抗原CA125、一级或二级亲属中有无恶性肿瘤病史(尤其是乳腺癌、结直肠癌、女性生殖肿瘤)。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者及志愿者均签署知情同意书。

1.2 高通量测序技术检测MMR基因

采集所有患者和健康人外周静脉血8 ml，用DNA提取试剂盒(血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司)提取基因组DNA。采用电泳检测DNA的质量，用Qubit3.0荧光定量仪及配套的核酸定量试剂盒(Qubit dsDNA HS Assay Kits，购自Thermo Fisher Scientific)对DNA进行浓度检测。通过多重PCR的方法，特异性的捕获MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2的突变区域，PCR体系中每个样本均有各自对应的标签，PCR结束即完成文库构建。对构建的文库采用磁珠法进行纯化，然后用Qubit3.0荧光定量仪和配套的核酸定量试剂盒对每个文库DNA进行浓度检测。将多个文库DNA按照等质量混合制备成上机文库原液，浓度稀释后采用Illumina Miseq测序仪上机测序。然后通过生物信息分析判断靶序列是否发生突变。检测流程如图1所示，实验步骤严格按照说明书进行操作。

图1 高通量测序技术检测MMR基因流程

1.3 Sanger测序法验证

采用Sanger测序法验证新一代高通量测序的结果。选取一些在高通量测序结果中有MMR基因位点变异的代表样本DNA，进行PCR扩增，产物纯化后采用Sanger测序检测。Sanger测序法采用的PCR扩增引物和测序产物与新一代高通量测序法所用的一致。

1.4 随访调查

采用门诊、住院复查或电话等方式对入组患者进行随访。随访时间的间隔参考了国内其他研究[7]。随访时间截止2020年12月。复发情况统计具体如下：对有无家族史患者的复发例数、不同病理分期患者的复发例数及复发时间进行分析统计，对复发患者的中位无瘤生存时间进行统计。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0进行统计学分析，计数资料采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床病理特点

入组患者年龄45～75岁，平均(58.0±6.2)岁；体重指数(BMI)16.4～27.1 kg/m2，平均(24.7±2.1)kg/m2；病理学类型子宫内膜样腺癌74例(高分化26例，中分化33例，低分化15例)、子宫内膜透明细胞癌5例、癌肉瘤4例、腺鳞癌3例；手术病理分期ⅠA期36例，ⅠB期19例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例，Ⅳ期5例；发病部位子宫下段38例，非子宫下段48例；有脉管瘤栓17例，无脉管瘤栓69例；首发肿瘤出现后，平均第二种肿瘤发病间隔5.8年，中位发病间隔为4.9年；CA125指标水平4.20～677.3 U/ml，平均(58.6±3.8)U/ml，其中34例患者超过正常水平；11例患者有糖尿病或高血脂病史。

2.2 MMR基因突变情况

高通量测序检测结果显示，86例样本中发生MMR基因突变的共有66例，总突变率为76.8%。共发现12种非同义单核苷酸变异(SNV)、2种同义SNV。在非同义SNV中，位于MLH1基因上的突变类型有3个：p.I219V：c.A655G、p.V384D：c.T1151A、p.Q701K：c.C2101A；位于MSH2基因上的突变类型有3个：p.L390F：c.C1168T、p.T564A：c.A1690G、p.E809K：c.G2425A；位于MSH6基因上的突变类型有2个：p.G39E：c.G116A、p.E1163V：c.A3488T；位于PMS2基因上的突变类型有4个：p.R20Q：c.G59A、p.K541E：c.A1621G、p.P470S：c.C1408T、p.T485K：c.C1454A。在同义SNV中，位于MSH6基因上的突变类型有1个：p.T1102T：c.T3306A；位于PMS2基因上的突变类型有1个：p.S260S：c.C780G。每种突变类型对应的患者例数如表1所示。

表1 MMR基因突变情况

2.3 Sanger测序验证结果

对MLH1、MSH2、MSH6和PMS2基因上不同突变位点的Sanger测序结果如图2所示。将Sanger测序与新一代高通量测序的突变位点及碱基突变形式进行比对，结果均显示一致。

图2 部分样本Sanger测序结果

2.4 复发情况

中位随访时间为54.0个月，随访期间，11例患者失访，9(10.5%)例患者复发，其中5例在5年内复发，中位复发时间为48.2个月，4例在5年后复发，中位复发时间为56.6个月。不同年龄段复发例数差异无统计学意义(P=0.739)；有家族史组复发6例，无家族史组3例，有家族史组复发率明显高于无家族史组(P=0.003)；ⅠA复发3例，ⅠB 2例，Ⅱ2例，Ⅲ1例，Ⅳ1例，差异无统计学意义(P=0.817)。中位无瘤生存时间为42.0个月，其中无家族史组、有家族史组中位无瘤生存时间分别为：(52.33±0.58)月、(36.33±1.21)月，差异具有统计学意义(P<0.001)。

3 讨论

近年来，随着人们寿命的延长、长期食用激素类药物以及肥胖等高风险因素的增加，EC发病率趋势逐渐上升。对于EC高危人群，除了关注患病的高危因素并改变不良生活习惯外，更重要的是要进行EC早期筛查，尽可能早期发现早期治疗。普通女性人群患EC的概率为2.3%，而携带MMR突变基因的LS家族女性患EC概率高达60%，因此通过早期检测MMR基因来筛查EC十分有意义。人类MMR基因能够检验和校正复制期间发生在微卫星样重复DNA序列上小的插入和丢失、防止解旋的DNA序列重新结合。而MMR基因一旦发生突变，MMR蛋白的功能将受到破坏，从而引起重复DNA序列的产生并且DNA修复出现错误，导致DNA表现为MSI。MSI会促使癌基因激活或抑癌基因失活，最终诱发癌变[8-10]。目前MMR基因突变检测方法主要是一代测序，对单个样本的多个基因检测时，需要逐一进行，这种检测方法成本高、速度慢、通量低，不适合临床上做大样本筛查工作。而多重PCR靶向富集结合新一代高通量测序可以对目标基因进行深度测序，从而可以高效准确的研究与疾病最相关的基因，并且高通量测序方法成本低、速度快、通量高，目前已经成为临床上多种疾病进行相关基因检测和生命科学研究的重要工具[11-12]。本研究采用多重PCR靶向富集结合高通量测序方法对EC患者样本进行检测，MMR基因MLH1、MSH2、MSH6和PMS2突变类型的测序结果与Sanger测序结果一致，表明采用新一代高通量测序方法来检测MMR基因的胚系突变的准确度可靠。86例豫西地区EC患者测序结果表明发生MMR基因突变的共有66例，总突变率为76.8%，说明豫西地区EC患者同时有MMR基因突变的概率高达76.8%。86例测序结果共发现12种非同义SNV、2种同义SNV。将本研究检测出的突变位点在NCBI基因数据库中检索分析，发现导致EC致病或可能致病的突变类型是位于MLH1基因上的18号外显子p.Q701K：c.C2101A；而MSH2基因上的14号外显子p.E809K：c.G2425A的突变是致病性不确定的类型；剩下的8种非同义SNV和2种同义SNV均为可容忍的变异可能与EC的发生没有关联。范怡梅等首次发现p.Q701K：c.C2101A突变，提高了患者患胃肠肿瘤的风险[13]。YAP HL等在2例肿瘤样本中检测出p.Q701K：c.C2101A突变，但是在对照组非肿瘤样本中未检测出该突变，对2例突变样本进行MSI检测，共检测出4个位点阳性[14]。本研究中致病或可能致病的类型p.Q701K：c.C2101A和p.E809K：c.G2425A的突变率高达11.6%，表明通过检测MMR基因突变情况可以大概率的筛查出EC，因此针对EC高危人群，早期通过MMR基因检测进行EC筛查显得尤为重要，可以尽早进行治疗干预。对EC患者复发情况随访，9例患者复发，复发率高达10.5%。其中5例在5年内复发，4例在5年后复发，不同年龄段复发例数差异无统计学意义(P>0.5)；有家族史组复发6例，无家族史组3例，有家族史组明显高于无家族史组(P<0.5)；无家族史组、有家族史组中位无瘤生存时间分别为：52.0个月、36.0个月，差异具有统计学意义(P<0.5)，随访调查表明EC术后易复发，无瘤生存时间短。文献研究表明在EC患者中，有5%的子宫内膜癌是和遗传易感性有关的[3]。因此对于EC高危人群尽早进行MMR基因测序检测，对患者早期治疗及对临床管理及指导用药均具有重要意义。

国外对LS的研究已进行了多年，但在我国仍处于起步阶段。对肠外肿瘤尤其是女性LS高发的EC的研究非常少，中国人群的EC的MMR基因大样本研究还没有开展。多重PCR靶向富集结合新一代高通量测序技术用于MMR基因的突变检测成本低、速度快、通量高，可用于对EC高风险女性的筛查，从而为EC临床规范化治疗提供更多资料。