血清miR-92a、miR-196a表达与宫颈癌淋巴结转移的相关性

孙 倩 王 宇 邱卫强

宫颈癌的治疗主要为以手术及放化疗为主的综合治疗，可有效延长患者的生存时间，但受多种因素影响，部分患者预后并不理想[1]。据报道，淋巴结转移与宫颈癌患者预后密切相关，且合并淋巴结转移的患者预后相对较差[2]。因此，明确宫颈癌患者淋巴结转移情况尤为必要。目前已证实，微小核糖核酸(MicroRNA，miRNA)在细胞的多种生理过程中发挥作用，若miRNA异常表达可导致疾病发生，包括恶性肿瘤[3]。其中miR-196a被证实可促进胰腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤发生[4]。miR-92a也可通过多种信号在恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移中发挥作用[5]。结合上述机制，血清miR-92a、miR-196a的异常表达可能与宫颈癌淋巴结转移也有一定关系，但目前相关报道较少。基于此，本研究将重点观察血清miR-92a、miR-196a表达与宫颈癌淋巴结转移的关系。

1 材料与方法

1.1 纳入对象

回顾性分析2018年6月至2019年12月医院收治的44例伴淋巴结转移的宫颈癌患者资料，纳入淋巴结转移组，另采集同期收治的44例无淋巴结转移宫颈癌患者资料，纳入无淋巴结转移组。纳入标准：①经病理检查确诊为宫颈癌；②首次就诊；③均为原发肿瘤；④预计生存时间>3个月；⑤实验室检查资料、病例资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并其他妇科疾病；③术前接受放、化疗等抗肿瘤治疗；④术前伴有急慢性感染性疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病。

1.2 方法

1.2.1 淋巴结转移评估方法 查阅所有患者入院时MRI、CT等影像学检查资料，参照标准[6]，统计患者淋巴结转移情况。

1.2.2 miRNA检测方法 全部患者在入院时均接受血清相关指标的检测，且检测结果资料保存完整。入院时，采集患者清晨空腹静脉血3 ml，3000 r/min离心10 min，离心半径为10 cm，收集上层血清，加入1 ml提取剂Trizol，放置于-70 ℃冰箱中保存，按照总RNA快速提取试剂盒说明书，提取总RNA，采用美国ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR反应，以U6为内参，miRNA逆转录反应体系15 μl∶5 μlRNA模板，3 μl U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μl 100 mmol/l脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，1μl 50U/μl逆转录酶，10×反转录缓冲液1.5 μl，0.19 μl 20 U/μl RNase抑制剂，4.16 μl双蒸水。反应条件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min。扩增反应体系为20 μl∶1 μl引物及探针Mix(20×)，10μlTaqMam 通用混合物溶液(2×)，1.33 μl反转录产物cDNA，7.67 μl双蒸水。扩增条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃复性60 s进行45个循环，每个反应体系荧光信号达到设定阈值所经历循环数即为Ct值，采用2-△△Ct法计算miR-92a及miR-196a水平，其中△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3 基线资料统计 设计基线资料填写表详细记录患者的一般资料，包括年龄、肿瘤直径、病理类型[7][鳞癌、腺癌、其他(包括腺样囊状性癌、腺样基底细胞癌、腺鳞癌、未分化癌等)]、分化程度(高分化、中分化、低分化)，血清肿瘤标志物[糖类抗原199(Carbohydrate antigen199，CA199)、糖类抗原125(Carbohydrate antigen125，CA125)，入院时取静脉血3 ml，3000 r/min离心10 min，采用放射免疫法测定]。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 淋巴结转移、无淋巴结转移宫颈癌患者资料比较

淋巴结转移宫颈癌患者的血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a均高于无淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)；组间其他基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 淋巴结转移、无淋巴结转移宫颈癌患者的基线资料比较

2.2 各主要指标与宫颈癌患者淋巴结转移关系的回归分析

将2.1中比较差异有统计学意义的变量纳入作为自变量，将宫颈癌患者淋巴结转移情况作为因变量(1=转移，0=未转移)，经Logistic回归结果显示，血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a的异常表达可能与宫颈癌患者的淋巴结转移有关，血清CA199、CA125、miR-92a、miR-196a过表达可能是宫颈癌患者淋巴结转移的风险因子(OR>1，P<0.05)，其中miR-92a、miR-196a的过表达检验所得的OR值较高，可作为独立风险因子，见表2。

表2 各主要指标与宫颈癌患者淋巴结转移关系的回归分析结果

2.3 血清miR-92a、miR-196a预测宫颈癌患者淋巴结转移风险的价值分析

将宫颈癌患者的血清miR-92a、miR-196a作为检验变量，淋巴结转移情况作为状态变量(1=转移，0=未转移)，绘制ROC曲线(图1)结果显示，血清miR-92a、miR-196a单一及联合预测宫颈癌淋巴结转移风险的AUC均>0.80，预测价值均较理想，且以联合检测价值最佳。各指标对应特异度、灵敏度、cut-off值及约登指数见表3。

图1 血清miR-92a、miR-196a预测宫颈癌患者淋巴结转移风险价值的ROC曲线图

表3 血清miR-92a、miR-196a预测宫颈癌患者淋巴结转移风险的价值分析结果

3 讨论

据报道，部分宫颈癌患者在就诊时便伴有淋巴结转移，且随着疾病的进展，淋巴结转移发生率逐渐升高[8]。因淋巴结转移与宫颈癌患者预后密切相关，若在早期明确淋巴结转移发生情况，可能对疾病治疗干预措施的制定有重要意义。

CA125、CA199是重要的血清肿瘤标志物，被证实与恶性肿瘤的发生发展密切相关，其中CA125为广谱肿瘤标志物，是1种糖蛋白，主要从上皮性卵巢癌抗原中检出，宫颈癌患者的血清CA125水平均有不同程度升高[9]。而CA199属于黏液糖蛋白抗原，分布于胰腺、胆管上皮等，是存在血液循环的肿瘤相关抗原[10]。有相关研究采用CA125、CA199联合诊断宫颈癌取得满意效果[11]。由此猜测，血清CA125、CA199可能与宫颈癌患者淋巴结转移有关。本研究在比较淋巴结转移与无淋巴结转移患者的血清CA125、CA199后，经Logistic回归分析结果显示，血清CA199、CA125异常表达与宫颈癌患者淋巴结转移风险有一定关系，二者过表达可能是宫颈癌患者淋巴结转移的风险因子。证实上述猜测，但因CA199、CA125不仅在诸多恶性肿瘤疾病患者血清中呈过表达，且在受炎症、免疫等其他因素影响后，也有一定程度升高，特异性及稳定性不佳；且在本研究中二者经回归分析所得的OR风险值也偏低，难以在评估宫颈癌患者淋巴结转移中发挥重要作用，因此本研究未将其作为主要的指标观察分析。

相关研究指出，miRNA具有肿瘤标靶的作用，可能同时兼具促癌基因和抑癌基因的作用[12]。而一个miRNA分子可靶向多个基因表达进而发挥生物学活性，miR-92a为生物体内重要的转录后调控因子，主要发挥癌基因作用，可促进癌细胞凋亡[13]。miR-196a作为miRNA家族中一员，已有不少研究证实，miR-196a在肿瘤组织中呈过表达，具有致瘤作用，可促进肿瘤生长，增强细胞对化疗药物敏感性，并与肿瘤患者预后密切相关[14]。由此，推测血清miR-92a、miR-196a也可能与宫颈癌患者淋巴细胞转移有关。本研究结果显示，淋巴结转移宫颈癌患者的血清miR-92a、miR-196a均高于无淋巴结转移患者，初步推测血清miR-92a、miR-196a可能与宫颈癌患者淋巴结转移有关，且该推测在进一步的回归分析检验中被证实，简单分析原因：miR-92a过表达可导致某些靶向癌基因过度激活，通过抑制P21的表达和促进细胞周期进展来促进宫颈癌肿瘤细胞的增殖，继而引起淋巴结转移的发生[15]。而miR-196a可能通过参与并促进宫颈上皮癌变过程，具有促癌基因功能，同时通过调控多种基因促进宫颈癌细胞的增殖，如miR-196a过表达可下调Radixin基因表达，进而促进细胞侵袭，同时可通过调节PaP1A基因表达促进细胞的侵袭，进而诱发淋巴结转移[16]。

在证实miR-196a、miR-92a与宫颈癌患者淋巴结转移的关系后，进一步绘制ROC曲线发现，血清miR-92a、miR-196a单独及联合预测宫颈癌淋巴结转移风险的AUC均>0.80，预测价值均较理想，且以联合检测价值最佳。上述结果不仅证实血清miR-92a、miR-196a与宫颈癌患者淋巴结转移有关，且说明了血清miR-92a、miR-196a对未来宫颈癌淋巴结转移风险的评估及预测有较高的应用价值，即宫颈癌患者若入院时血清miR-92a、miR-196a呈过表达，其可能有较高的淋巴结转移风险，临床应尽早行影像学或病理检查，明确淋巴结转移情况，可能对指导早期治疗有积极意义；同时可在未来治疗中将miR-92a、miR-196a作为靶基因，以为患者选择合适的药物治疗，或可对延长患者的生存时间、改善生存质量有积极意义。

综上所述，宫颈癌淋巴结转移可能与血清miR-92a、miR-196a异常表达有关，若在入院时检测患者血清miR-92a、miR-196a呈过表达，可能提示淋巴结转移高风险。