液相联用原子荧光形态价态仪测定安宫牛黄丸中可溶性形态价态砷的方法研究

(上海市崇明食品药品检验所，上海 202150)

1 引言

安宫牛黄丸被誉为“中医温病三宝”之首，是《中国药典》2015年版一部收载品种[1]，自《中国药典》1977年版一部收载后，历版药典均有收载。

按照中医理论分析：处方中牛黄苦凉，清心解毒，辟秽开窍[2],在此方中具有重要意义。历年来广大医药工作者对于安宫牛黄丸的基础研究、临床应用和药理药效等方面做了非常大量的研究工作，作为中医治疗高热症最为有效的要方，其机理已由药理实验和临床疗效初步进行了科学的阐明[3]。但是作为中医药独有的矿物药，雄黄(二硫化二砷As2S2)中含大量砷(70%)，故而被列入国家医用药品毒性药品目录。在临床实践和日常生活中，有关这类中药的毒性也经常见诸报端：端午节饮用“雄黄酒”致命、长期服用“牛黄解毒片”产生中毒症状，或是民间猪心加朱砂熬汤后急性中毒等，其原因主要是由于对于该类药物的普遍认知不足[4]和药物的不合理运用。

安宫牛黄丸中的雄黄的安全性和有效性根据文献报道,可对其价态砷的定量来衡量评价[4]，在了解雄黄的作用机制的基础上，解决安宫牛黄丸中可溶性砷的价态检验项目设置、方法学摸索和限度标准设定，进行深入研究和确定合理的质量分析方法，保障人民用药安全。目前国内及国际通用测定砷形态价态的主流方法为HPLC-ICPMS,该仪器在药品检测领域主要依赖进口，购买成本及后期使用成本较高，而原子荧光形态分析仪是我国具有完全自主知识产权和生产能力的仪器，而且购买和后期使用成本相对较低，所以开发原子荧光形态分析仪的检验检测方法即有利于降低药企质控成本，又能推动我国自主仪器研发的能力和动力。

2 材料与方法

2.1 仪器、试剂与材料

液相联用形态价态仪(液相泵：LUMTECH Clamflowplus；进样器：LUMTECH Autosampler；形态：仪器形态预处理装置 SAP-20；原子荧光：AFS-9320)；QUINTIX224-1CN万分之一电子天平；BRANSON 8510超声清洗仪；VORTEX GENIE 2涡旋振荡仪；SIGMA 3-18K高速离心机；HPLC-ICPMS(U3000-ICAPQ)；Milli-Q A10纯水机。

硝酸(色谱纯)；氢氧化钾(分析纯)；硼氢化钾(分析纯)；乙二胺四乙酸二钠(分析纯)；磷酸二氢铵(分析纯)；胰酶(分析纯)；纯水(电阻率≥18MΩ)。

砷酸根标液(GBW08667，批次1804，纯度以As计：17.5±0.4μg/g)；亚砷酸根标液(GBW08666，批次1804，纯度以As计：75.7±1.2μg/g)。

安宫牛黄丸3批：广州某药业有限公司(批号：X03003M，规格：每丸重3g)；杭州某药业有限公司(批号：180407，规格每丸重3g)；北京某制药厂(批号：17013721，规格每丸重3g)。

2.2 实验方法

2.2.1标准溶液的制备

精密称取砷酸根标液0.5715g，亚砷酸根标液0.1322g，置于同一个20 mL量瓶中，加水稀释至刻度，配制成砷酸根(As5+)浓度为500ng/mL、亚砷酸根(As3+)500ng/mL(均以砷计)的标准储备液。精密量取5mL置10mL量瓶中，加0.02mol/L的乙二胺四乙酸二钠溶液至刻度制成250ng/mL(以砷计)的标准储备液。

2.2.2标准曲线制备

取250ng/mL的混合标准储备液，通过仪器自动调整进样量，稀释制成含As5+12.5、25、50、75、125、250ng/mL，含As3+12.5、25、50、75、125、250ng/mL的系列混合标准溶液，分别测定峰面积，以砷酸根、亚砷酸根系列标准浓度为横坐标，以测定的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数。

2.2.3样品处理

取广州某药业公司的安宫牛黄丸作为测试样品，剪碎并混匀，取约0.15g，精密称定，置250mL量瓶中，加人工肠液5mL静置1小时使充分膨胀后，加人工肠液适量涡旋2分钟，再静置半小时，再涡旋2分钟后超声半小时，取出涡旋2分钟后静置1小时，再涡旋2分钟，静置超声均在37℃条件下进行，用人工肠液定容至刻度，摇匀，取适量至50mL离心管中，静置16小时，取中间液10mL，用10μm微孔滤膜过滤，精密量取滤液2.5mL至10mL量瓶中，加0.02mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4仪器条件

(1)液相条件：流动相：0.025mol/L磷酸二氢铵溶液(调节pH至6.0)；流动相流速：1.5mL/min；色谱柱：CNWSEP AX HPLC Colum 250×4.0mm 10μm；进样量：满环100μL，自动稀释最小进样量5μL。

(2)原子荧光条件：负高压320V，总电流80mA，辅电流40mA，载气300mL/min，屏蔽气500mL/min。(3)形态分析仪条件：载液：5%硝酸；还原剂0.35%氢氧化钾及2%硼氢化钾混合溶液。

3 结果

3.1 标准曲线

As3+在12.5～250ng/mL，As5+在12.5～250ng/mL的范围内均呈现良好的线性关系，结果见表1，色谱图见图1。

表1 标准曲线和相关系数

图和标准曲线峰面积叠加谱图

3.2 重复性和中间精密度结果

取广州某药业公司样品，精密称取0.15g，0.3g，0.45g 3个重量梯度并每个重量梯度称取3份，照2.2.3进行样品处理，并将处理后样品分别通过液相联用原子荧光形态价态仪和HPLC-ICPMS测定。

表2 液相联用原子荧光测定结果

续表2

表3 电感耦合等离子质谱仪测定结果

续表3

3.3 稳定性试验结果

3.3 回收率试验结果

取广州某药业公司样品，精密称取9份，每份约0.15g，平均分成3组，分别加入3个浓度梯度砷酸根与亚砷酸根标液，照2.2.3进行样品处理，并将处理后样品通过液相联用原子荧光形态价态仪测定。

图2 液相联用原子荧光形态价态仪测定样品谱图

试验结果表明,液相联用原子荧光分离安宫牛黄中的价态砷的三水平加标As3+的回收率分别为118.4%、103.3%、101.6%，As5+回收率分别为112.6%、108.5 %、102.0 %，回收率在该条件下的结果均在85%～120%之间，基本满足药品质量标准分析方法指导原则项下的准确度要求[5]，具体结果见表4。

表4 As3+与As5+加标回收率

3.5 实验结果

通过同法试验测定，杭州某药业公司的安宫牛黄丸As3+结果为140.3mg/kg，As5+测定结果为26.43mg/kg；北京某药厂的安宫牛黄丸As3+结果为134.4mg/kg，As5+测定结果为24.90mg/kg。测定结果表明，这3个厂家的3批安宫牛黄价态砷的含量都处于比较安全的范围。

4 小结与讨论

本次试验在初期探索仪器条件时期发现，使用梯度洗脱时，可对4种砷的价态(砷酸根，亚砷酸根，一甲基砷、二甲基砷)进行很好的分离，但由于安宫牛黄丸中3个批次都没有检出一甲基砷和二甲基砷，故最后采用了检出能力更高的等度洗脱，稳定性也更好。在样品前处理方法探索时，发现提取液中价态砷的含量呈现随时间推移从低到高再到基本稳定的状态，故最后确定本试验最终的一个样品前处理方法。通过本次试验，基本建立一套完整的液相联用原子荧光形态价态仪测定安宫牛黄丸中的模拟人体环境的可溶性形态砷的定量测定方法，即完成了对安宫牛黄丸该品种的质量控制的完善，也为国内仪器厂商提供了新的道路。