响应面法优化瓦尼桑黄菌液态发酵工艺

李学震，郑明珠，马艳蕊，和法涛*，刘光鹏

（1.吉林农业大学，吉林长春 130118；2.中华全国供销合作总社济南果品研究院，山东济南 250220）

瓦尼桑黄（Sanghuangprous vaninii）是桑黄菌的一种，由于其跟桑树桑黄（Sanghuangprous sanghung）物种亲缘关系很近，所以具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等活性功能[1]。研究表明，桑树桑黄只生长在桑树的活木上，自然生长条件局限，人工栽培困难[2]。而瓦尼桑黄菌生长条件容易控制，可以进行人工代料栽培，因此近年来被广泛种植[3]。桑黄主要功能成分有多糖、多酚、黄酮和三萜等[4]，其中多酚化合物是桑黄菌的次级代谢产物之一，桑黄子实体和菌丝体中均含有多酚类物质[5]。桑黄素是桑黄菌中的多酚类物质之一，可以抑制香蕉中水溶性多糖的降解，从而延缓香蕉在贮藏过程中的软化和变质[6]。虽然，杨树桑黄可以进行人工栽培，但是生长周期长、需要不断调整每个生长阶段的生长条件。桑黄菌液态发酵可以大量生产桑黄菌菌丝体，菌丝体中含有大量的多酚类物质，且接种量少，发酵周期短，只需要5～7 d[7]。

有研究表明，在培养基中加入真菌激发子[8]、脂类物质[9]、桑树产物[10-11]和稀土元素[12]等，可以有效提高桑黄菌液态发酵中黄酮、多糖和三萜等目标产物的产量。Ma 等[13]发现在培养基中分别添加0.03 g/L 萘乙酸和0.02 g/L 豆香素，可以明显提高桑黄菌液态发酵中的黄酮产量，但以不同粮食作为桑黄菌液态发酵培养基尚未见报道。因此，本实验选用5 种不同粮食作物作为液态发酵培养基的碳源，4 种动植物氮源和两种桑产物，在单因素实验的基础上，采用Plackett-Burman 实验设计和中心组合实验设计，优化了桑黄菌液态发酵的生产工艺，为桑黄菌液态发酵生产多酚类物质及产品利用与开发提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌株

桑黄菌菌株，由山东省临清市哲硕农产品有限公司提供，经山东省农业科学院鉴定为瓦尼桑黄菌（Sanghuangporus vaninii）。

1.1.2 培养基

PDA 培养基，购自青岛宾得生物技术有限公司。PDB培养基，购自北京索莱宝生物科技有限公司。

基础培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.75 g，氯化钙0.75 g，蒸馏水1 L。

1.1.3 试剂

葡萄糖、无水氯化钙、无水碳酸钠，天津大茂化学试剂厂；磷酸二氢钾、七水硫酸镁，国药集团化学试剂有限公司；福林酚试剂，上海麦克林生化科技有限公司；无水乙醇，天津富宇精细化工有限公司，以上试剂均为分析纯。酵母粉，赛默飞世尔科技公司；牛肉膏，国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨，北京双旋微生物培养基制品厂；桑叶、桑葚由山东省临清市哲硕农产品有限公司提供；小米、玉米、高粱、荞麦、豆粕、麸皮均为市售。

1.1.4 仪器与设备

BSC-150 恒温培养箱、YXQ-LS-100A 型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；手持搅拌器，扬州均瑞机械设备有限公司；无菌操作台，深圳蓝思净化科技有限公司；打孔器，广州科友生物科技有限公司；UV-1000 型紫外分光光度仪，上海天美科学仪器有限公司；TDL-5A 低速大容量离心机，上海安亭科学仪器有限公司；ME-104 型万分之一天平，梅特勒托利多仪器有限公司；HH-4 型数显恒温水浴锅，金坛市杰瑞尔电器有限公司；R308 型旋转蒸发仪，上海申生科技有限公司；ZWYR-2112B 型恒温调速摇床柜，上海智诚分析仪器制造有限公司；FD-2 型真空冷冻干燥机，上海比朗仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种平板活化与制备

取实验室中已分离纯化后的桑黄菌菌株斜面，在无菌操作台上取0.5 cm2接入PDA 平板，菌株长到4～6 cm时，保存于4 ℃冰箱中备用，使用前在28 ℃培养箱中恒温培养6 h。

1.2.2 发酵种子液制备

取平板上的菌丝，用直径5 mm 的打孔器打孔，接入PDB 培养基，装液量每瓶100 mL/250 mL，每瓶接种4块。28 ℃、150 r/min 振荡培养7 d，待菌种长满摇瓶，用手持搅拌器在无菌操作台内将菌丝打散，但不破坏细胞，放入4 ℃冰箱备用，使用前在摇床28 ℃恒温培养6 h。

液体发酵培养：将制备的种子液，接入配置好的培养基中，接种量10%，装液量200 mL/500 mL，每个菌种3瓶。28 ℃、150 r/min 振荡培养7 d。

1.2.3 桑黄菌液态发酵培养基的碳源筛选

选择5 种粮食作物为碳源小米粉、玉米粉、薏米粉、荞麦粉、高粱粉，添加量均为2%，分别加入基本培养基中。培养条件：26 ℃，装液量200 mL，摇瓶转速150 r/min，500 mL 摇瓶培养7 d，抽滤得菌丝体，冻干后测多酚含量和菌丝生物量。

1.2.4 桑黄菌液态发酵培养基氮源筛选

选择4 种常见的氮源：豆粕粉、麸皮粉、酵母粉、牛肉膏，添加量均为1%，分别加入基本培养基中，培养条件同1.2.3，抽滤得菌丝体，冻干后测量多酚含量和菌丝生物量。

1.2.5 桑黄菌液态发酵培养基生长因子筛选

选用两种生长因子：桑叶粉和桑葚粉，添加量均为1%，分别添加到基本培养基中。培养条件同1.2.3，抽滤得菌丝体，冻干后测多酚含量和菌丝生物量。

1.2.6 Plackett-Burman 实验设计

根据单因素实验结果配制培养基，将制备好的瓦尼桑黄菌种子按照实验设计的接种量进行接种。PB 试验设计包括8 个因素，即小米粉、酵母粉、桑叶粉、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2、pH 和接种量；以上8 个因素各设置高水平（+1）和低水平（-1），实验设计见表1。

表1 Plackett-Burman 试验的因素和水平编码值Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.7 中心组合实验设计

根据Plackett-Burman 实验结果，利用Design-Expert 10.0 软件对具有显著性的因素包括小米粉、磷酸二氢钾、接种量进行中心组合实验设计，并以桑黄菌菌丝总多酚得率为响应值，进行三因素三水平实验设计，共20 个实验点，详见表2。

表2 中心组合实验设计因素及水平Table 2 Factors and levels of central composite design

1.2.8 桑黄菌菌丝生物量及总多酚含量测定

将发酵培养液抽滤得菌丝体，将菌丝体取出用蒸馏水清洗3 次，再抽滤后，在-40 ℃条件下预冷冻24 h，冷肼温度-80 ℃，真空度10 Pa 条件下冻干12 h，称重法测菌丝生物量。桑黄菌丝总多酚得率按照冉军舰等[14]的方法进行标准曲线的绘制与测定。

1.2.9 数据处理

采用Origin 9.0 进行绘图，SPSS Statistics 22.0 进行数据统计与分析，Design-Expert 10.0 进行实验设计及方差分析。

2 结果与分析

2.1 总多酚含量测定标准曲线的建立

采用福林酚法，在765 nm 处测定吸光度，总多酚标准曲线：y=1.320 8x＋0.000 6，R2=0.998 5，线性范围为10～160 μg/mL。

2.2 发酵培养基碳源的筛选结果

不同植物碳源加入液态发酵培养基，以桑黄菌菌丝生物量和多酚含量为指标进行筛选[15]。由图1 可以看出，以小米粉为碳源发酵桑黄菌的菌丝生物量和多酚含量均最高，分别为2.21 g 和2.05 mg/g。玉米粉发酵的桑黄菌丝体多酚含量1.82 mg/g，菌丝生物量为1.12 g。高粱粉发酵桑黄菌菌丝生物量和多酚含量均最低，分别为0.35 g和1.06 mg/g。荞麦粉发酵桑黄菌菌丝体生物量为0.59 g，与薏米粉发酵桑黄菌相差3 倍左右，但菌丝多酚含量高于薏米粉发酵桑黄菌，为1.23 mg/g；薏米粉发酵的桑黄菌菌丝生物量和多酚含量分别为1.68 g 和1.12 mg/g。综上，小米粉发酵的桑黄菌两指标均最佳，因此选择小米粉为液态发酵培养基碳源。

图1 不同植物碳源对桑黄菌发酵的影响Fig.1 Effects of different plant carbon sources on the fermentation of Sanghuangprous

2.3 发酵培养基氮源筛选结果

图2 显示了不同氮源对桑黄菌发酵的影响。由图知，以豆粕粉为氮源发酵的桑黄菌菌丝生物量和多酚含量分别为1.66 g 和1.52 mg/g，低于酵母发酵桑黄菌的菌丝生物量（2.01 g）和菌丝多酚含量（2.48 mg/g）；同为植物氮源，以麦麸为氮源发酵的菌丝生物量只有0.77 g，多酚含量仅1.13 mg/g；牛肉膏发酵得到的菌丝生物量最低，为0.57 g，但多酚含量高于麦麸，为1.31 mg/g。综上，选择酵母粉作为氮源进行桑黄菌液态发酵较适宜。

图2 不同氮源对桑黄菌发酵的影响Fig.2 Effects of different nitrogen sources on fermentation of Sanghuangprous

2.4 发酵培养基生长因子筛选

有研究表明，桑树枝水提物能增加桑黄菌液态发酵的菌丝生物量，及发酵液中有效成分的含量[10]。本实验采用桑叶和桑葚作为生长因子，考察其对桑黄菌液态发酵菌丝生物量和多酚含量的影响，结果见图3。由图可知，添加1%桑叶粉后，桑黄菌液态发酵菌丝生物量为1.34 g，菌丝多酚含量为1.85 mg/g，明显高于添加1%桑葚粉发酵的菌丝生物量（1.14 g）和多酚含量（1.22 mg/g）。因此，选用桑叶粉作为液态发酵培养基的生长因子。

图3 不同生长因子对桑黄菌发酵的影响Fig.3 Effects of different growth factors on the fermentation of Sanghuangprous

2.5 Plackett-Burman 实验设计结果及方差分析

根据文献，除本实验筛选的碳源、氮源及生长因子外，微量元素、pH 值和接种量也对菌丝多酚含量产生影响。因此，对影响桑黄菌菌丝多酚含量的8 个因素，即小米粉（X1）、酵母粉（X2）、桑叶粉（X3）、MgSO4·7H2O（X4）、KH2PO4（X5）、CaCl2（X6）、pH（X7）、接种量（X8）进行了研究。结果如表4 所示，当X2和X5处于低水平，X1、X3、X4、X6、X7、X8处于高水平时，桑黄菌丝多酚含量达到了2.51 mg/g；当X3、X7、X8处于低水平，X1、X2、X4、X5、X6，桑黄菌丝多酚含量仅有0.32 mg/g。

表4 Plackett-Burman 实验设计结果Table 4 Results of Plackett-Burman experimental design

通过Design-Expert 10.0 软件对Plackett-Burman 实验结果进行数据分析，在所进行实验的8 个因素中，有3个因素对结果影响显著，分别是小米粉、KH2PO4和接种量。根据拟合方程：Y=+1.63-0.19X1-0.16X2+0.18X3-0.06X4-0.32X5-0.09X6+0.16X7+0.28X8可知，R-Sq(adj）=87.77%，说明方程拟合度良好。由表5 可知，在影响试验结果最显著的3 个因素中，X8对试验结果影响最大，X5次之，X1最小，其中X1和X5系数为负值，说明呈现负效应，X8系数为正值，说明呈现正效应。

表5 Plackett-Burman 实验方差分析Table 5 Variance analysis of Plackett-Burman

2.6 中心组合实验设计结果及方差分析

采用中心组合实验设计，以多酚类化合物为评价指标，对培养基中小米粉、KH2PO4加量和接种量进行优化，结果见表6。利用Design-Expert 10.0 软件对实验数据进行分析，得到桑黄菌菌丝体中多酚含量（Y）与小米粉（A）、KH2PO4（B）、接 种 量（C）之 间 的 回 归 方 程：Y=2.53+0.21A+0.31B+0.21C+0.19AB+0.22AC+0.10BC-0.29A2-0.51B2-0.31C2。

表6 中心组合实验结果Table 6 Result of central combination design

回归分析表明（见表7），模型P＜0.000 1，说明回归方程差异极显著，实验设计可靠，同时失拟项P=0.077 9＞0.05 不显著，表明此模型与实际值的吻合度高，模型精确。R2=0.937 4，即约93.74%桑黄菌菌丝多酚变化可由上述模型解释，说明该模型的预测值与实际值之间的相关度较好。模型中1 次项A、B、C 对桑黄菌菌丝多酚影响显著，交互项AB、AC，二次项A2、B2、C2对多酚含量影响显著，显著性次序为B＞A＞C。

表7 中心组合实验结果方差分析Table 7 Variance analysis of central combination design

2.7 响应面分析

图4 是通过Design-Expert 10.0 软件处理得出的结果，对培养基中小米粉、KH2PO4和接种量3 个因素的两两交互作用进行分析。当接种量一定时，菌丝总多酚含量随着KH2PO4和小米粉添加量的增加先增后减。KH2PO4等高线图的变化密集，小米粉的等高线变化较稀疏，即KH2PO4对菌丝多酚含量的影响比小米粉显著（图4a）。当KH2PO4一定时，桑黄菌菌丝多酚含量随接种量的增加而增加，随小米粉含量的增加先增大后减少，且两者有较强的交互作用，相对于小米粉等高线比接种量的密集，即接种量比小米粉对菌丝多酚影响显著（图4b）。当小米粉含量一定时，多酚含量随接种量的增加而增加，随KH2PO4含量先增加后减少，两者没有显著的交互作用，相对接种量而言，等高线向KH2PO4变化较密集，因此KH2PO4对菌丝多酚含量影响较接种量显著（图4c）。

图4 响应面等高线图Fig.4 Contour map of response surface

综上所述，根据模型预测的最佳发酵方案为小米粉24.00 g/L、酵母粉10 g/L、桑叶粉10 g/L、KH2PO41.08 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl21 g/L、pH 6.5、接种量11.64%，在此条件下发酵的桑黄菌菌丝体总多酚含量预测值为2.62 mg/g。

2.8 验证实验

根据上述培养基配方进行验证实验，检测理论值与实际结果是否一致。在三次平行试验后，测得桑黄菌发酵菌丝多酚含量为2.63 mg/g，相对误差在±0.5%以内，且有较好的重复性，表明培养基优化结果正确可靠。

3 结论与讨论

本试验在三组单因素实验的基础上，筛选出适用于桑黄菌液态发酵的碳源、氮源和生长因子，结果表明：小米、酵母粉和桑叶粉对桑黄菌液态发酵高产菌丝体和总多酚均有显著影响。通过PB 实验设计和中心组合实验设计及响应面分析，优化了桑黄菌液态发酵多酚高产的发酵工艺条件，即小米粉24.00 g/L、酵母粉10 g/L、桑叶粉10 g/L、KH2PO41.08 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、CaCl21 g/L、pH 6.5、接种量11.64%，在此条件下发酵桑黄菌菌丝总多酚含量为2.62 mg/g。在验证实验中，桑黄菌菌丝总多酚含量为2.63 mg/g，相对误差较小，实验效果稳定，可以为以液态发酵法大量生产桑黄菌丝多酚提供理论支持。