颅面部器官发育中Msx1和Pax9的研究进展

霍苏曼，刘刈钊，丁 成，羊雪芹

(1. 杭州师范大学生命与环境科学学院浙江省器官发育与再生技术研究重点实验室，浙江 杭州 311121； 2. 杭州师范大学附属医院，浙江 杭州 310015)

哺乳动物颅面部器官如牙齿、腭板、舌头等是机体重要的功能单位，其器官发生和发育过程由颅面神经嵴来源的间充质细胞和相邻组织的相互作用所调节[1-3].这些组织之间的相互作用是通过成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、刺猬蛋白(sonic hedgehog，SHH)、WNT等信号通路以及转录因子包括Homeo-box、Paired-box、T-box等组成的复杂网络来实现的[4-9].其中转录因子Msx1和Pax9对哺乳动物颅面部器官的发育非常关键，人类MSX1基因缺陷会表现出唇腭裂、牙齿发育不全等先天性缺陷，敲除小鼠也有同样的表型[7,10-13].唇腭裂是人类最常见的新生儿颅面部缺陷，也是颅面部器官发育缺陷中的典型表型，其发生主要涉及腭板和牙齿等器官的发育.本文拟通过综述哺乳动物中转录因子Msx1和Pax9的基因表达和功能，分析并探索两者在哺乳动物颅面部器官发育中的协同作用，以期为进一步研究颅面部器官发育的分子网络奠定基础.

1 Msx1与Pax9的基因表达

脊椎动物Msx基因最初是从小鼠中克隆出来的，被鉴定为果蝇肌节同源盒基因(muscle segment homeobox，Msh)的同源基因.Msh家族成员中的Msx1和Msx2在小鼠胚胎发生过程中有共同的DNA结合位点，作为抑制因子在上皮-间充质相互作用的部位表达，在腮弓、四肢和神经系统表现出部分重叠的功能[14-17]，另一家族成员Msx3仅局限表达于背侧神经管中[18].

Pax家族中的Pax9与Pax1高度同源，同属于Pax1/9亚家族.Pax1/9在腮弓、胸腺、骨骼形成等发育方面有重要作用.Pax9是上皮和间质细胞的一个重要转录因子，最早出现在小鼠胚胎期第8.5天(E8.5)的前肠上皮细胞，随后在腭板发育过程中表现出口—鼻和颊—舌的梯度表达[19-20].

生物体中基因的功能与表达位置密切相关.哺乳动物腭板和牙齿的早期发育都是通过外胚上皮与神经嵴来源的间充质之间相互作用而完成.哺乳动物腭板的形成时期集中于E12.5—E15.5，包括腭板的垂直生长、抬升、水平生长和融合过程.腭板向舌的方向进行垂直生长的过程(E12.5—E13.5)中，Pax9在腭板前端口—鼻轴方向的间充质呈现由高到低的梯度表达，腭板后部中口—鼻均有强烈表达，而Msx1高表达于上颌磨牙附近的腭板间充质，且具有严格的时空特异性[7,19,21-23].E13.5—E15.5期，腭板处于从抬升到融合过程，Pax9在其中的表达由高峰逐渐减弱至最终消失，Msx1则没有明显的表达[22-23].

胚胎发育早期Msx1和Pax9的活跃表达是牙齿发育的一个启动信号，对牙齿的形成有重要的作用[22].以小鼠的第一磨牙为例，其早期发育过程依次经历牙板期、蕾状期、帽状期以及钟状期4个时期.E11.5牙板期时，Msx1开始集中表达于下颌骨增厚的上皮周围的间质细胞，激活BMP和FGF信号通路.E12.5—E15.5期牙上皮细胞增殖并向下生长侵入下层间充质，牙源性上皮向下缓慢生长，其间Msx1表达量最大，钟状期后表达量快速下降[19].E10.5牙齿发生之前，Pax9就开始在牙胚间充质表达启动牙齿发育信号，之后持续在间充质表达以调节周围细胞增生和组织形成[7].

2 Msx1的功能

脊椎动物胚胎发育过程中，Msx1在临近上皮的间充质中表达，参与信号传导过程，激活或者抑制下游基因的转录，影响腭板和牙齿等器官的发生和发育.例如，Msx1能够通过作用于下游基因MyoD，抑制骨骼肌分化[24-25].Msx1的缺失，会导致腭板间充质神经嵴来源的细胞增殖活性降低，同时牙间充质会出现错误的分化现象[26]，敲除小鼠的Msx1基因会破坏正常细胞周期进程，导致腭板间充质的细胞增殖失调进而引起腭裂[27].Msx1缺失的小鼠还表现出无牙以及颅面部骨骼发育异常等表型[22,26,28].人类疾病研究发现，Msx1的基因突变患者往往表现出牙齿发育不全、少牙症、牙齿畸形、唇腭裂等部分或全部缺陷，影响人类的面部形态和正常的生理生活[4,11,28-29].

Msx1对肿瘤生长、胚胎着床等生物活动也有重要的调节作用[4,29].人类的多种恶性肿瘤(如乳腺癌、子宫内膜癌等)确定与Msx1的下调相关.研究发现，在肿瘤发生过程中，Msx1可以通过诱导G1/S细胞周期阻滞和细胞凋亡抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，控制肿瘤细胞的进展[30-32].另外，哺乳动物Msx1基因能通过控制子宫间质和上皮细胞之间的旁分泌信号来调控胚胎着床.在胚胎着床前，Msx1等转录因子重叠表达于子宫上皮和基质中，在小鼠中敲除Msx1会使得子宫上皮细胞表现出持续的增殖活性，无法附着在胚胎上，导致胚胎植入失败[33].

3 Pax9的功能

哺乳动物胚胎发育中Pax9非常关键.研究发现，在表皮-间充质互作的腭板发育过程中，Pax9沿腭板从后向前呈现梯度表达并对腭板的生长、抬升和融合起关键作用，突变体胚胎中的Bmp4、Fgf10、Msx1和Osr2基因表达显著下调，突变小鼠表现出腭裂和牙齿发育停滞[7,23,34].在腭板间充质中特异性敲除Pax9，使得上皮细胞中腭板生长的正反馈因子SHH的表达下调，细胞分裂受到影响从而导致腭板发育受阻[7,34-35].Pax9敲除会导致WNT信号通路的抑制因子Dkk1表达下调，在Pax9敲除小鼠中同时过表达Dkk1，能够部分挽救Pax9缺失后导致的腭裂现象[36-37].小鼠胚胎发育的E10.5—E12.5期，Pax9作为一种优先启动表达的因子，在牙齿间充质区域的标志性表达，提示Pax9对牙齿发育的整个过程都具有调控作用[7].小鼠胚胎发育中Pax9的缺失，会导致牙齿发育在蕾状期就停滞[7,21,23]，人类PAX9突变则与非综合征型牙齿发育不全、综合征型发育不全以及少牙症密切相关[11].

在胸腺、肢芽、味蕾和骨骼的形成与发育等方面，Pax9也非常重要.小鼠胚胎发育的E8.5开始，血管和咽部内胚层的发育需要Pax9的参与，突变体中血管发育受影响会导致先天性心脏缺陷，在咽部内胚层Pax9的表达过程中，胸腺上皮细胞中Pax9基因的缺失干扰内胚层向周围间充质组织内陷，影响早期胸腺的生成[38-39].研究发现Pax9缺陷小鼠舌中部的周缘乳头和叶状乳头发育停滞，且Pax9对于发育和分化阶段的舌真菌状乳头必不可少，表明Pax9对味蕾祖细胞的发育和命运决定非常必要[7,40].Pax9还影响哺乳动物肢芽的发育，突变小鼠表现为前肢多趾、后肢缺陷[7].此外，Pax9还能影响骨骼的形态发生过程，在发育中的椎骨和四肢中都有表达[20].

图1 Msx1与Pax9信号网络及功能示意图Fig.1 The diagram of the signaling regulation network and functions of Msx1 and Pax9

4 Msx1与Pax9的协同作用

总体而言，在哺乳动物颅面部器官的发生和发育过程中，Msx1和Pax9对于腭板和牙齿的发育都非常重要.敲除Msx1基因会破坏正常细胞周期进程，导致腭板间充质的细胞增殖失调进而影响腭板融合[22]，Pax9在腭板前后轴的表皮-间充质互作中调控基因表达，两者都影响着腭板的生长、抬升和融合[7,37].Msx1作为牙间质的重要调节因子，不仅受到牙上皮信号的调控而表达，而且还调节下游靶基因并反馈信号至上皮[22,41]，具有严格的时空特异性，缺失会导致牙齿停止发育表现出无牙.同样局限表达于牙间充质的Pax9，是牙源性间充质的标志物，突变小鼠牙齿发育在萌芽阶段就停滞了，与多数牙先天缺失密切相关[7].因此笔者推测，在依赖于上皮-间充质互作模式的器官发育过程中，Msx1与Pax9存在于一定的信号网络中(图1)，Pax9可能是Msx1的上游基因，或者两者在某些生化过程中存在协同作用.

腭板发育方面的研究发现，Pax9敲除的小鼠与Msx1敲除的小鼠类似，突变鼠均具有腭裂并结合无牙表型[10-11]，并且人PAX9的基因突变也会导致腭裂[42-44].此外，在怀孕的Pax9缺陷小鼠的胚胎中，WNT信号抑制剂Dkk1的介导能够挽救腭板的发育，而同样情况下Dkk1不能挽救Msx突变小鼠的牙齿形态[37,45].Pax9在腭板中对Msx1基因的表达有调控作用[34]，提示Pax9很可能是通过Msx1来调控腭板发育的.我们预测Msx1、Pax9、Osr2和Bmp4之间形成一定的信号网络，且Pax9对Msx1具有直接的正向调控作用(图1).

在对牙齿的研究中发现，Pax9在牙齿间充质中具有信号启动的作用[7].研究发现早期牙齿发育过程中Pax9具有独立于Msx1的关键功能，且在Msx1和Osr2的上游遗传起作用，Pax9 能够直接调控Msx1，并且在蛋白水平与MSX1相互作用，反向激活牙齿发育中Msx1和Bmp4的表达[23].Pax9对于Bmp4的表达调控早于Msx1，并且在涉及Bmp4的信号通路中，Pax9和Msx1具有协同作用[23].在转录水平上，Pax9与Msx1相互作用并通过形成蛋白复合物调控Bmp4的表达，决定牙齿从芽期到帽期过渡的发育过程[23,40]，影响门牙大小和对称性的多个信号传导通路[27].Msx1与Pax9在基因组水平特定位点的单核苷酸多态性，与牙齿发育不全及关联腭板发育问题密切相关[46].生化分析表明，Osr2通过Msx1和Pax9蛋白质的物理相互作用在牙源性间充质发挥调控作用[23].临床研究发现，人类牙齿发育中MSX1和PAX9具有协同作用，免疫沉淀和GST相互作用试验也发现两种蛋白质之间存在物理联系.进一步的生化数据和人类遗传学及小鼠模型的表达分析，也显示Msx1与Pax9在牙齿发育过程中有功能性关联[11,43].

综上所述,Msx1和Pax9基因在哺乳动物颅面部中表达，与腭板和牙齿的发生发育密切相关，并且存在于一定的信号网络中，在器官发育和功能调节中具有协同作用.然而作为转录因子，Msx1和Pax9基因如何调节细胞内信号，如何介导组织间相互作用，如何影响下游靶基因在器官发生中的细胞过程和生物学活动等都需要更多的科学实验来研究.