球兰属内生菌研究进展

王玉芬

（大同市城市园林绿化研究中心，山西大同 037000）

1 球兰属植物

球兰属（Hoya）是萝藦科（Asclepaidaceae）中牛奶菜族（Marsdensieae）的一个属，球兰属植物在中国的分布区域有广东、云南、贵州、西藏、海南、广西、福建和台湾等（P.T.Li et al.，1997）。

《全国中草药汇编》中，记录民间使用球兰一般取其茎、叶或全株入药，或绞汁或水煎服用，外用时捣烂敷于患处，球兰之所以能起到治疗疾病的效用，与球兰中含有的有效化学成分密切相关。球兰属植物含有多种化学成分，包括孕（甾）烷、孕（甾）糖苷脂类、甾醇、黄烷醇、三萜、倍半萜等。Kyogoku 研究了日本广岛市民的疾病治疗中出现的球兰过敏引发的职业性哮喘，在球兰中发现了2 种螨致敏的过敏原；Alen 等发现H.diversifolia的甲醇提取物对松材线虫具有体内抗癌活性；球兰属植物叶片中含有植物甾醇和α-谷甾醇具有较强的抗炎、消炎等生物活性的作用。

2 球兰属植物内生菌的鉴定

真菌的鉴定主要依托于其形态学特征，但对于内生真菌而言，特殊的生活环境决定了它与常规的植物病原菌鉴定不同，一是内生真菌在与宿主植物长期的共同进化过程中，为了适应其内生的环境，某些形态特征发生改变；二是用来培养繁殖内生菌的培养基自身具有选择性，也不能正常还原其真实的生存环境，培养过程本来就是一个重新选择的过程，具有大概率的不确定性，结果无法真实反映原始群落结构。

在内生菌中有一些菌株不产孢，给内生菌的鉴定带来了困难，例如一些寄生于植物体内的炭角菌很难产生有性或无性孢子，不易从形态学上去鉴定。常规的研究是根据不产孢株在培养基上的形态特征将其划分为不同的形态型（morphotype），但是这种形态型不具有真正的分类意义，在调查油松内生真菌的过程中，将分离到的不产孢菌株根据它们的培养特征划分为74 个形态型，然后通过rDNA 中的ITS 和5.8S 基因序列分析，发现74 个形态型菌株属于担子菌纲和子囊菌纲中的64 个分类单元，与形态型的划分存在一定的差异。

随着分子生物学技术的成熟，利用分子生物学手段进行分类已经广泛应用，该法可信度高，比较常用的分子生物学方法包括DNA 指纹技术、分子杂交、rDNA序列分析等。对于真菌物种鉴定来说，仅使用形态学方法面临一些问题，形态学鉴定耗时较多，有些类群缺乏足够的鉴定特征，例如单细胞和不产孢的类群。目前学者们亲睐于使用DNA 序列分析的方法推断类群间系统发育关系，同时结合形态学特征进行物种鉴定，既可靠又节约时间。

目前最广泛用于分子系统学研究的基因片段是ITS 区，该基因片段在真菌的分子系统学研究中有着举足轻重的作用。迄今为止，基于ITS 区序列分析，已成功地界定了多种真菌类群及其若干个体。然而，ITS序列变异位点不够多并不能用来区分所有的种，早前对链格孢5 个种菌株的18S rDNA、5.8S rDNA 及ITS1、ITS2 进行了序列分析就证明，基于ITS 序列不适合用于部分类群的区分。

RPB2 是一个具有较快的进化速率的单拷贝基因，同时该种RNA 聚合酶亚基在细胞发挥的作用很难受细胞结构或者生理学的影响。前人通过比较油桐叶枯病病原菌的培养性状、产孢结构特征并结合分析核糖体rDNA ITS 序列以及RPB2 序列和系统发育关系鉴定病原菌；RPB1、RPB2 这2 个蛋白编码基因在研究担子菌的系统发育学关系中，解决很多rDNA 解决不了的问题，线粒体Cytb 基因应用于真菌种内和种间的分类、鉴定，同时是作为进化和系统发生分析方面理想的分子标记，在国际上已经得到了很高的评价。

线粒体基因组具有自己特定基因组成、遗传密码和复制方式。真菌线粒体基因组中的编码蛋白基因均是线粒体自身特有的与氧化磷酸化和线粒体蛋白质的合成相关的基因，构建线粒体基因的系统进化树能够为真菌的鉴定提供参考，纠正部分真菌分类学的错误（张波，2007）。秦培刚等（2011）对水稻丝核菌AGIIA的线粒体ATP6 基因和Cytb 基因以及从NCBI/Genbank 中各真菌的对应基因进行同源性比对，构建了ATP6 基因和Cytb 基因的系统进化树从而为水稻丝核菌的分类鉴定提供依据。贺丹（2007）扩增线粒体Cytb基因发现该基因分析能够纠正并完善真菌地霉、粘束孢霉及相关菌株一些形态学鉴定和分类上的不确切之处。线粒体Cytb 基因应用于真菌种内和种间的分类、鉴定，同时是作为进化和系统发生分析方面理想的分子标记，在国际上已经得到了很高的评价。

3 炭角菌的研究进展

在真菌索引上，炭角菌属名下有700 多个混名，是炭角菌科中最大的一个属。炭角菌的主要特征有：圆柱形的子囊，深色的单细胞有裂缝的子囊孢子，成熟的炭角菌有垂直的，圆柱形的或是棍棒状的子座，分生孢子分布于稠密的栅栏组织。较多的炭角菌分离自蚂蚁、白蚁的巢穴。在俄罗斯分离到3 个炭角菌，鉴定为新种，分别是Xylaria lepidota、X.sibirica和X.primorskensis。

早期对炭角菌的研究集中于昆虫巢穴以及根部腐烂的研究；然而，炭角菌分类混乱，近年来较多的研究集中在炭角菌系统发育方面，通过β-微观蛋白、RPB2、α-肌动蛋白序列研究炭角菌属同白蚁蚁穴炭角菌属和Xylarioideae的亚科之间的系统发生关系。

邓叔群在《中国的真菌》中描述了52 种国产炭角菌，其中分布最广的有6 个种，它们大多生于腐木或木材上，黑柄炭角菌（X.nigripes） 和巴西炭角菌（X.brasiliensis）生于地上，果生炭角菌（X.carpophila）生于枫香的落果上。炭角菌中研究最多的当属黑柄炭角菌（X.nigripes），其菌核又名乌苓参、乌丽参、雷震子和吊金针等。它生长于地下2～20m 的土栖白蚁废弃的蚁巢上，研究表明，乌灵菌粉具有调节免疫、镇静安眠、脑保护、抗疲劳、耐缺氧、抗衰老、利尿、降低血清尿素氮的作用等。

前人对炭角菌科的次级代谢产物和生物活性物质已经进行了广泛的研究。研究发现一些代谢物具有药理学作用，例如抑菌特点、抗癌性、抗癌抗菌素等。从Palicourea marcgravii分离到的Xylaria sp.显示出抗菌活性；Xylaria sp.BCC4297 产生的一个新的复合物对癌细胞株具有细胞毒性作用；大部分的Xylariaceous真菌已经被证实有很强的降解纤维素和木质素能力，造成生理学上的腐烂，有效地降解了担子菌的基质，目前促进衰退作用的酶类已经被大规模地开发。

用于研究细胞骨架的第一个药物是细胞松弛素B（Cytochalasins B），它是真菌分泌的生物碱，在细胞内同微丝的正端结合，可以引起F-肌动蛋白解聚，进而阻断亚基的聚合。把细胞松弛素加到活细胞以后，肌动蛋白纤维骨架消失，会导致动物细胞的各种活动瘫痪，包括细胞的移动、吞噬作用、胞质分裂等，它对微管不会起作用，也不抑制肌收缩，炭角菌在生长过程中或是在代谢过程中可分泌细胞松弛素，从而为人类提供了开发可利用的天然药物资源。

Abate et al（1997）从X.obovata ADA-228 的代谢产物中分离得到可用作驱虫剂的Clonostachydiol，同时发现这种菌类在发酵后期会形成许多的被氧化的细胞松弛素；Pittayakhajonwut 等从X.mellisii BCC 培养物中分离到了细胞松弛素C 和细胞松弛素D，Isaka 等对菌株Xylaria sp.BCC 21097 次级代谢产物的研究表明该菌次级代谢产物可以抵抗几种癌细胞系；刘小莉（2007)评价银杏内生菌Xylaria sp.子实体的抗氧化活性认为Xylaria sp.是一种潜在的抗氧化剂，胡志钰（2008）从Xylaria sp.NCY-2 菌株液体培养基发酵产物中分离并鉴定了21 种化合物，对分离得到的新化合物进行了抗菌和抗肿瘤活性测定，结果表明它们具有抗菌和抗肿瘤的活性。从研究中可以发现，炭角菌属类的真菌具有大量的活性物质，而且它的一级以及次级代谢产物可以产生许多抑菌、抗肿瘤、抗氧化等较罕见的化合物，对今后研究具有药用价值的代谢产物或者具有抗癌性等天然产物具有较高的引导性。