一种透射电镜离散细胞的样品制备法

孙竹林 姬 曼 赵君朋

(首都医科大学中心实验室电镜室，北京 100069)

透射电镜(Transmission Electron Microscopy TEM)是生命科学领域超微形态学研究的重要手段。TEM生物样品制备过程复杂且步骤繁多，因此样品制备对实验的成败至关重要。其中离散细胞样品(如血液，胸腹水样本等)因其细胞数量少、且相对分散，这类样品的收集制备一直是个难题[1-3]。以往，离散细胞样品通常采用离心沉淀法先将细胞悬浮后离心，积聚成团块再进行常规电镜制备[1]。此方法一般要求有足够的细胞数量，细胞离心后易成团且比较牢固，不然制备过程中经多次换液、离心处理后很难得到足量细胞样品，最终导致制样无预期结果[1-4]。有研究用明胶预包埋法处理离散细胞样品，但该方法的明胶温度难以控制，容易造成细胞变形等问题[2-4]。本研究采用天然蛋白胶体(蛋清)对离散细胞样品进行预包埋处理，既易保存样品原有数量，又不影响固定包埋效果。

1 材料和方法

1.1 材料

试剂：2.5%戊二醛；1%锇酸；0.1mol/L 磷酸缓冲液；spon812树脂；乙醇；环氧丙烷。

仪器：透射电子显微镜1400Plus；超薄切片机UC6；全自动组织处理机EM TP；烤片台；烤箱。

1.2 方法

1.2.1细胞的收集

分别取大鼠骨髓全血和血管平滑肌细胞悬液各1.5mL入尖底离心管，离心15min(1500转/min)弃上清。

1.2.2固定与漂洗

加2.5%戊二醛固定液(4℃预冷)固定1h。适量0.1mol/L 磷酸缓冲液漂洗3次，每次5min。

1.2.3预包埋

首先将已处理的细胞团吸取至滤纸上吸干水分，随后取新鲜鸡蛋开小孔，吸取适量蛋白(蛋清),滴于预热的载玻片表面(约50μL/滴)，待蛋白微凝时(呈灰白色)，将细胞转移至蛋白凝块，使其包埋于其中，再次将载玻片置烤片台上加热至蛋白完全凝固状态(呈白色)。

1.2.4后固定

将预包埋后的细胞白色混凝团转入1%锇酸固定液中固定1h(4℃)。随后再次漂洗，条件同上。

1.2.5脱水渗透

经梯度乙醇50%、70%、90%、100%和环氧丙烷逐级脱水处理后(5min/次，各级2次)，再经spon812环氧树脂:环氧丙烷1∶1、3∶1，各40min，最后纯树脂浸透2h。

1.2.6包埋聚合

将样品转移至包埋模具中，置恒温干燥箱中升温聚合。聚合温度与时间分别为37 ℃，12h；45℃，12h；60℃，48h。

1.2.7切片染色

聚合后的包埋块经超薄切片机制备100nm超薄切片，置铜网上。先后用醋酸双氧铀15min、柠檬酸铅3min双染色。

1.2.8电镜观察

采用透射电镜1400Plus于100kV观察，分析软件收集图像。

2 结果

2.1 未预包埋组

两组细胞经过逐级脱水、渗透等步骤后，大部分已丢失，经包埋聚合，因残留样品太少，不能满足修块、切片的要求，无法进行超薄切片观察。

2.2 预包埋组

2.2.1骨髓细胞组样品

透射电镜下可见细胞呈集中分布，细胞间干净，种类丰富，形态多样，红细胞呈扁平状、淋巴细胞可见明显伪足样突起；样品图像反差明显，分辨率清晰，细胞间蛋白组织未见电子反差的异常现象(图1A)。超微结构观察可见各类细胞超微结构保存良好，细胞及细胞器的膜性结构完整，核膜及染色质清晰可见(图1B)。

2.2.2血管平滑肌细胞组样品

电镜下可见样本背景清晰整洁，细胞亦呈集中分布，细胞间距合理，无挤压、破损等形变，细胞间可见蛋白纤维，反差正常，对结构观察无干扰(图2A)；超微结构观察细胞膜清晰可见，表面的微绒毛突起，线粒体、内质网等细胞器结构完整；细胞核、核膜及染色质均完整清晰(图2B)。

图1 预包埋组骨髓细胞透射电镜图

由图1可知，预包埋组骨髓细胞(图1 A )细胞结构反差明显，分辨率清晰，细胞间未见电子反差的异常现象(bar=2μm)；超微结构观察细胞膜清晰可见(图1B)，表面的突起，线粒体、内质网等细胞器结构完整(bar=0.5μm)。

图2 预包埋组血管平滑肌细胞透射电镜图

图2表明，预包埋组血管平滑肌细胞 (图2A)细胞集中分布，细胞间距合理，无挤压、破损等形变，细胞间可见蛋白纤维，反差正常(bar=2μm)；超微结构观察细胞膜清晰可见(图2B)，表面的微绒毛突起，细胞器结构完整；核膜及染色质对比清晰(bar=0.5μm)；

3 讨论

蛋清是由蛋白质组成的透明的胶状物质，遇热后会凝固成白色固体故又称为蛋白。其主要成份为卵白蛋白，卵粘蛋白等。天然卵白蛋白加热时胶体变性凝固，卵粘蛋白热稳定性较强且具有较高的溶解度。因此，蛋清胶体热变性微凝时，形成海绵状凝胶，具有通透、保湿及防震保护的作用[5]。

本实验结果显示，蛋清包埋离散细胞样品中细胞呈集中分布，说明蛋白胶体易于细胞粘附，起到良好的聚集作用。包埋样品处理过程中脱水完全、渗透充分，电镜下观察细胞膜完整，细胞伪足或突起无损伤形变，超微结构保存效果良好，说明蛋白胶体通透性良好，且具有保护细胞表面的功能[5]。同时，实验结果也显示：包埋胶体蛋白未与树脂及染色颗粒发生化学变化，超薄切片厚度均匀稳定，质量满意。经醋酸铀及柠檬酸铅染色后，蛋白无异常，细胞分辨率和反差效果均良好。为了获得良好的实验结果，实验中需注意的以下事项：首先要使用新鲜蛋白，4℃储存蛋清不易凝固，影响包埋效果；其次，预包埋过程中，注意掌握凝固颜色和状态，蛋清由微黄色变成灰白色时，为胶体微凝状态，黏度适中有利于离散细胞的粘附与包裹；再者，制备过程中要避免牵拉、挤压或冲击等外力直接作用于包埋胶体，造成蛋白包埋体开裂分散。如可用木签或细针头辅助完成胶体包埋和转移，脱水、渗透等环节可使用样品处理仪替代人工换液。

该方法无需设备和试剂投入，具有简便快捷、易于操作、适用于多种细胞且效果显著等优点，为离散细胞超微结构的研究提供了一个实用、廉价的样品制备方法。