燃油微生物污染测定的不确定度评定

(中国石油独山子石化分公司质量检验中心，独山子 833699)

近年来，由于燃油产品的更新换代，品种增多，各种添加剂的频繁使用，不断有燃油因为微生物的存在，导致燃油性质改变，从而可能造成堵塞输油管路、过滤器、发动机等现象，给生产生活带来严重的后果[1-3]。一般微生物优先利用C10～C18碳链的烃类作为生长所需的碳源，所以柴油和航空燃油更容易受到微生物的污染[4]。因此严格控制燃油中微生污染物的量，才能确保燃油性质的稳定性和安全性。

测量不确定度是评定测量水平的指标，是判定测量结果的依据。因此正确评定测量不确定度对客观分析测量结果有重要意义。本文对燃油中微生物污染测定过程进行分析，给出了不确定度的评定过程。

1 试验过程

1.1 试验方法

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》的规定，按照ASTM D7463-2008进行试验研究。

1.2 方法概述

本方法是根据生物体所产生的光量与样品中三磷酸腺苷(ATP)的浓度成比例的方法，来测定三磷酸腺苷的含量，测量结果以相对光单位给出。该测试方法是用来估计活微生物量，旨在评估抗菌杀虫剂的功效、监控燃料储存和分配系统中微生物的污染。方法用来测量样品中ATP的浓度,它是所有活细胞的一个组分，它包括细菌和真菌。因此，ATP的出现是燃料系统中微生物污染的可靠指征。ATP与非生物起源物质无关。

1.3 仪器、材料与试剂[5]

微生物测试笔：使用环境温度为5℃～35℃，存储环境温度为2～8℃，在室温下存储不得超过3周，否则测试笔中的酶试剂将会失效，严禁使用过期微生物测试笔，具体见图1。

微生物测定仪：用以测定燃油和水中三磷酸腺苷总量，HY-LITE 2或同类型仪器。

图1 燃料测试笔和无ATP测试笔

专用测试瓶：用以测定过程中样品和专用试剂的混合。材料为高密度聚乙烯或等效材料，洗涤干净后可以重复使用，容量为250mL、500mL、1000mL，装样时应留有10%空间便于样品混合和震荡。

微生物ATP测试套装：由ATP测试笔和巴氏杀菌吸管组成。

1.4 取样要求

取样容器：使用耐油透明容器，要具有良好的密闭性，洁净、无尘，使用时禁止接触取样容器内部。必要时进行消毒处理(使用75%乙醇冲洗并吹干)。

取样量：如果采取样品体积小于500mL，可直接加入干净的样品瓶；如果大于500mL，当检测对象是油层时，将上层的500mL注入干净的样品瓶；当检测对象是水层时，应弃去上层部分油层，直至剩余体积小于500mL后全部注入干净的样品瓶。

样品要求：为防止微生物死亡和繁殖，样品应在取回后尽快测定，最长不应超过24小时。样品不能结冰和加热。若已收集的样品需在4小时后再进行测试，那么测试前应将其冰存或在0℃～5℃条件下冷藏。避免样品结冰。测试前样品应恢复至室温。

2 分析步骤

按照1.1所述分析方法操作。

3 建立测量数学模型

(1)样品水含量小于等于0.5%(v/v)时，按公式(1)计算每升样品的RLU值。

(1)

式中：RLU——仪器显示发光值

V——实际(燃料)样品容积，毫升，

D——稀释系数

b——试剂平均基础读数(如果试剂基础读数测不到，这个值设为20)。

(2)样品中可见水含量大于0.5%(v/v)时，不需要修正测定结果，结果按照RLU报出，如果样品被稀释，则按照公式(2)计算。

RLU=(RLU实际-b)×D+b

(2)

(3)报告结果精确到个位。

4 不确定度来源确定和分析

RLU值表示的是燃油微生污染物受萤光素酶作用后的发光值，该值直接体现出燃油中微生污染物的数量，是一个样品点的数据，一般要多测几个求平均值，才能反映整体水平。

本试验选取同一批次的样品制备15 份均匀样品,进行重复性测试,检测步骤主要包括样品量取、反应、静置、震荡及测定等。

不确定度来源因果图如图2 所示。由图2可见,该试验不确定度主要来源于样品的均匀性、样品的量取、静置条件等,以及重复性检测。

因本试验规定了在相同条件下(包括在一定的静置温度、静置时间、同一种测试笔等)反应、静置，我们只对量取、静置和反应及重复性检测所引起的不确定度进行分析量化,故燃油中微生污染物的不确定度主要来源于以下几个分量:

(1)重复性检验的不确定度；

(2)量取样品体积不确定度；

(3)静置和反应条件不确定度；

(4)萃取液吸取的不确定度。

图2 燃油微生污染物总数不确定度来源因果图

5 测量不确定度分量的计算

5.1 样品重复测量时,重复性引起的的不确定度U(n) (A类评定)

本试验选取同一批次的样品制备15 份均匀样品,由同一人员严格按ASTM D7463-2008进行燃油微生物污染重复性测试,得出一组数据,检测结果见表1 。

表1 同一批次燃油15个样的微生污染物测定结果 RLU/L

表1具体计算过程如下:

(1)共测量15 个样品,每个样品测量两次,样品的两次测量结果为x1j和x2j(表1中第2 列和第3列)。

(2)对测量结果x1j和x2j取对数,分别得到lgx1j,lgx2j以及两者的平均值(表1中第4、5、6列)。

(3 )对每一个样品分别计算其残差的平方和(表1 中第7 列)。

=(2.7738-2.7586)2+(2.7435-2.7586)2

=0.01522+(-0.0151)2

=0.00046

(4)由各样品的残差平方和,计算15 个样品的合并样本标准差，得到：

=0.0168

(5 )每一个样品测量两次,故样品微生物污染度的标准不确定度为:

5.2 量取体积引起的不确定度U(v)

本试验量取样品体积时需用250 mL 量筒。该体积有两个主要的影响因素:量筒校准和温度影响。

5.2.1校准引入的不确定度

由250mL 量筒引入的允许误差为±1.0 mL ,量筒的校准不确定度为：

5.2.2温度引入的不确定度

由于量筒和溶液实际温度与校准温度不同,规定出厂校准温度20 ℃,而量取试样平均温度为 15℃,温度对体积的不确定度的影响应由温度变化和体积膨胀系数来计算,由于玻璃的体积膨胀系数相比试样的体积膨胀系数较少,可忽略不计,在此仅考虑燃油的体积膨胀系数为13×10-4/℃。

U(vb)=250mL×15×13×10-4=4.875mL

则:将以上两个分量合成:

=4.909mL

5.2.3相对标准不确定度

按《燃油微生物污染测定法》要求,样品实际量取体积为250mL ,引起的相对标准不确定度为：

5.3 蓝色萃取液吸取移液体积量的标准不确定度U(l)

本实验吸取蓝色萃取液量用一次性吸量管吸取1 mL左右。温度对其影响极小,可以忽略不计。一次性吸量管吸取1 mL允许误差为±0.008 mL,故一次性吸量管吸取1 mL按均匀分布引起的不确定度：

则引起的相对标准不确定度为:

6 合成标准不确定度计算

由于各分量的不确定度来源彼此独立不相关,采用相对标准不确定度合成得：

=0.0234

7 扩展不确定

根据置信概率p=0.95 和自由度v=14,由t分布表得到包含因子k=2.14。于是扩展不确定为：

U95=k·Urel(r)=2.14×0.0234 =0.050

(1)根据表1 可知样品lg xj的取值范围,当样品的微生物污染度的lg值以区间的形式表示:

lgxj-0.050≤lgxj≤lgxj+0.050

取反对数,可知其微生物污染度结果分布的区间。

(2)测量不确定度结果报告对于第一个样品,从表1中可知

则它的取值范围为

2.7086≤lgx1≤2.8086

取反对数可知其微生物污染度结果可估算为：

(511～644)RLU/L 之间。

其它样品按同样方法计算。

8 结论

从以上计算结果可知，本文通过对燃油微生物污染度检验测定结果的测量不确定度来源进行分析和评估，可见由微生物污染度检验量取体积引起的不确定度U(v)是最大的，是本方法测量不确定度的主要来源，占不确定度的主要部分；其次为重复性引起的的不确定度U(n)，最后蓝色萃取液吸取移液体积量的标准不确定度U(l)也有影响,是不能忽略的。

基于以上分析结果,对于燃油微生物污染度检验测定引起的不确定度，可作如下思考：

(1)对于样品量取体积引起的不确定度，它主要由人员、环境及操作重复性产生，因此在燃油微生物污染度检验测定引入不确定度可以提高检测结果的有效性、科学性、公正性和可靠性，从而提高燃油微生物污染度的检验工作质量。

(2)由于燃油微生物污染度检验结果较大，直接计算其标准偏差不方便、不直观，且计算量大，容易出错，故取对数后进行计算。

(3)由于现目前的燃料油中加入了多种调合剂，极有可能影响燃料油的稳定性，在储存和运输过程中，导致微生物繁殖。由于以前发生发动机堵塞的情况很少，且检验部门对燃油微生物污染度检验不够重视，导致分析操作人员操作不够严谨。但近几年出现柴油发动机堵塞，导致车辆无法启动的问题越来越频繁，严重影响了人们的生活，而且，根据目前的检验发现，导致这种现象产生的最大可能原因就是燃油中微生污染物的存在，因此，要求各生产检测部门对燃油微生物污染度的测定引起足够的重视，所以要求检测人员熟练掌握各项操作技能，并严格按照规定的检测条件进行测定。