应用胶体金法检测叶类蔬菜中吡虫啉、多菌灵、啶虫脒、噻虫嗪的残留量分析

占绣萍，刘 彬，黄兰淇，陈 秀，马 琳，陈建波，赵 莉

(1.上海市农业技术推广服务中心，农业农村部农药质量监督检验测试中心，上海 201103；2.上海市青浦区蔬菜技术推广站，上海 201200)

随着农业产业化的发展，农产品的生产越来越依赖于农药、抗生素和激素等外源物质。我国农药在粮食、蔬菜、水果、茶叶上的用量居高不下，而这些物质的不合理使用必将导致农产品中的农药残留超标，影响消费者食用安全，严重时会造成消费者致病、发育不正常，甚至直接导致中毒死亡。农药残留超标也会影响农产品的贸易。但是传统的气相、液相、质谱等农残分析技术检测成本高、时间长，这就给食品安全监管部门对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便，因此也催生出大量的快速农药残留的检测技术。目前，胶体金免疫层析试纸法是快速诊断领域发展最快的技术之一，它是以胶体金作为示踪标记物，与抗原抗体特异性反应相结合的免疫分析技术。可通过目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。成本低、操作简单、稳定性高、特异性强，非常适合现场检测之用，它可以广泛适用于各级食品安全部门、蔬菜基地、农贸市场、卫生防疫、环境保护等领域的蔬菜、水果中农药残留检测，也适合家庭生活中个人健康的自我检测与保健。

蔬菜中的农药残留现象较为普遍，然而叶类蔬菜也是上海人民日常餐桌离不开的一道美味，因此叶类蔬菜在上海地产蔬菜生产中具有重要的战略地位。从2018年上海地产蔬菜农残抽检情况来看，叶菜类农残检出率最高，在所有抽检蔬菜品种中占比64.4%。其中超标或检出次数高的农药品种有啶虫脒、多菌灵、噻虫嗪、吡虫啉等农药。查询《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB 2763-2021)最大残留限量(MRL)，吡虫啉在大白菜等叶类蔬菜上MRL为0.2～5mg/kg，啶虫脒在普通白菜等叶类蔬菜上的MRL为1～5mg/kg，噻虫嗪在芹菜等叶类蔬菜上MRL为1～5mg/kg，多菌灵在结球莴苣等叶类蔬菜上MRL为5mg/kg。为满足蔬菜质量安全的监管和农户生产自检的需要，笔者对胶体金免疫层析法测定蔬菜中啶虫脒、多菌灵，噻虫嗪、吡虫啉等农药的残留技术开展了应用研究，并通过仪器法进行灵敏度、特异性、假阴性率、假阳性率，以及检测结果与参与方法的一致性等的技术评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、多菌灵快速检测试剂盒，浙江大学研制；吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、多菌灵(1 000mg/L)。甲醇(色谱纯)，研磨珠，0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)：KH2PO40.27g；无水Na2HPO41.14g；NaCl 8.0g；KCl 0.2g 用双蒸水定容至1L。

1.2 仪器与设备 Agilent 1290 UPLC-Agilent 6460 MS/MS超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪：配ESI源，超声波(JumpUltransonic cleaning)，TDL-5-A离心机；Milli Q超纯水系统；旋涡混合器(SCI LoGex MX-S)。

1.3 检测方法

1.3.1 胶体金法 原理：利用竞争型免疫反应原理建立金标层析试纸方法，通过肉眼识别试纸检测区域显色从而判定农药残留量情况。主要识别原件为农药抗体与抗原，将各农药的特异性抗体(鼠源IgG，一抗)分别记于胶体金上，相应的人工抗原和兔抗鼠IgG(二抗)分别固定为T线包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上，兔抗鼠IgG为C线包被于NC膜上。样品垫上滴加样品提取液，使金标抗体溶解并与提取液中的待测物预反应，层析运动到T线后，固定的人工抗原、液相中的待测物与液相中的金标抗体发生竞争结合反应。若T线颜色弱于C 线颜色或不显色，即样品中的多菌灵、吡虫啉、啶虫脒或噻虫嗪含量等于或超过产品检出限；反之则说明检测含量低于产品检出限。

前处理：取(2.0±0.1)g 剪碎或搅碎后的样品加入到15mL或50mL 离心管中;量取并加入10mL20%甲醇-0.01mol/L磷酸盐缓冲液混合溶剂，并加入1份玻璃研磨珠，超声/涡旋振荡提取1min，4 000r/min高速离心5min，取上清液待测。

检测：加样液：将速测卡盒平衡至室温，打开包装后将速测卡平放，用滴管吸取待测液，分别滴加3滴于加样孔中，加样在15～30s内完成。反应计时：液体流动时开始计时，反应3～5min，并进行结果判读。若T线颜色≥C线颜色，则结果为阴性(未检出)；若T线颜色

图1 胶体金法速测卡检测结果判定

1.3.2 仪器法 前处理方法：基本同胶体金法，上清液过0.22μm有机相滤膜，待测。

色谱条件：色谱柱：Agilent poroshell 120EC-C18柱(3.0mm ×100mm，2.7μm)；以0.1%甲酸(A相)和甲醇(B相)为流动相进行线性梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～1.0min，A相的比例保持90%；1.0～4.0min，A相的比例由90%降到5%，停止时间为7min。流速为0.35mL/min;进样量：2μL；柱温：40℃。

质谱条件：采用AJS ESI源，ESI+电离模式，多反应监测(MRM)；干燥气温度与流 速：300℃，7L/min;鞘气温度与流速：350℃，12L/min;毛细管电压：正离子3 000v。

2 结果与分析

2.1 不同基质的灵敏度试验 查询《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》(GB2763-2019)中对吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵在叶类蔬菜中的限量标准(表1)。

表1 吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵在叶类蔬菜中的限量

本试验选定了青菜、生菜、杭白菜、菠菜等6种不同蔬菜品种和三档加标浓度。每种蔬菜均设置4个浓度，即本底浓度(空白)、低、中、高浓度(表2～3)。从表中可以看出，通过胶体金速测卡法测定吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、多菌灵4种农药的检出限分别为0.05、0.05、0.01、0.25mg/kg，完全能满足国家残留限量标准的要求。

表2 吡虫啉、啶虫脒的灵敏度试验结果(n=3)

表3 噻虫嗪、多菌灵的灵敏度试验结果(n=3)

2.2 实验室假阳性率试验 根据灵敏度试验中验证的6种蔬菜进行市场抽检，随机抽检10份蔬菜，并用液相色谱-串联质谱法确认浓度低于胶体金的最低检出含量，再用胶体金试纸条进行检测以验证其假阳性率。液相色谱-串联质谱法中吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵的最低检出限分别为6.50、0.51、9.20、0.69μg/Kg。结果(表4)，部分样品有检出农药残留，但低于胶体金法的检出限，4种农药的胶体金法假阳性率均为0。

表4 吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵的假阳性率结果(n=3)

续表

2.3 实验室加标假阴性率试验 以上用于假阳性率检测的10份样品根据4种农药在胶体金法中的检出限浓度进行加标验证，吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵的添加浓度分别为0.05、0.05、0.01、0.25mg/kg。结果(表5)，4种农药的假阴性率均为0。

表5 吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵的假阴性率结果(n=3)

2.4 田间阳性样品 本试验在基地选择生产过程中未使用过农药的青菜，分别喷洒主要药效成分为吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、多菌灵的农药品种，喷洒后3d采摘新鲜蔬菜运送到实验室，先用实验室串联液质法对4种农药残留量进行测定，再将样品稀释到产品产品最低检出限的0.5、1.0、2.0倍水平。每个检出水平做10个重复。验证结果用《食品快速检测方法评价技术规范》来评价胶体金方法的灵敏度、特异性、假阳/阴性率和与参比方法一致性(表 6)。田间阳性样品验证吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵残留的假阴性率均为0，噻虫嗪在0.005mg/kg 测试浓度有2例假阳性，总体来看4种农药的假阳性率分别为 0、0、5.0%和0，但与参比方法均无显著性差异(χ2<3．84)。

表6 吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵的田间阳性样品的验证结果

3 讨论与结论

本研究通过胶体金免疫层析速测法检测叶类蔬菜中吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵农药残留，可在15～20min内完成一件样品从前处理到速测卡显色读取的全部检测过程，并用串联质谱仪进行验证，相比检测结果无显著差异。该方法简便、快速、高效和省成本，且检测灵敏度较高，能满足国家标准对吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和多菌灵的限量要求。这充分验证了吡虫啉等4种速测卡用于田间上市前的检测，作为基层蔬菜采摘上市前农药残留自我检测的应用手段，能真正解决蔬菜上市前的安全问题。

目前国内基层单位监管市场使用的农药残留速测仪，主要是针对有机磷类和氨基甲酸酯类农药，而近年来我国蔬菜种植上使用农药的种类已不再是有机磷类和氨基甲酸酯类为主，主要是以中低毒的农药为主，所以针对目前蔬菜上广泛使用的农药开发相应的速测卡非常有必要，农药残留胶体金免疫层析试纸卡的尽快稳定、成熟，将具有可观的应用发展前景。可作为基层检测部门快速初筛的手段，也真正符合政府管理部门及公众呼吁的农产品质量安全从源头管理的理念。